El salting out, también conocido como precipitación inducida por sal, fraccionamiento de la sal, cristalización antisolvente, cristalización por precipitación o ahogamiento, es una técnica de purificación que utiliza la solubilidad reducida de ciertas moléculas en una solución de muy alta fuerza iónica.
La ciencia detrás del salting out es asombrosa. Este método ayuda a precipitar proteínas y ADN y se convierte en una herramienta clave en biotecnología, salud, investigación y desarrollo de nuevas terapias.
Definición de salting out
La salazón es un método de purificación que utiliza la solubilidad reducida de ciertas moléculas en una solución de muy alta fuerza iónica.
A diferencia del salting in, el salting out se produce en soluciones acuosas de alta fuerza iónica que reducen la solubilidad de la molécula y hacen que ciertas proteínas precipiten.
Idealmente, el tipo de sal que se utiliza y la concentración de la misma pueden variar para precipitar selectivamente una molécula.
Dado que la concentración de sal necesaria para que una proteína determinada precipite fuera de la solución difiere de una proteína a otra, se puede utilizar una concentración de sal específica para precipitar una proteína objetivo.
Cómo funciona el salting out
La conformación de las grandes biomoléculas in vivo suele estar controlada por interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas con el entorno celular.
Estas interacciones rigen en gran medida la conformación final de la molécula al plegarse de forma que la mayoría de los grupos funcionales hidrofóbicos queden protegidos del entorno celular polar.
En el caso de las proteínas, son los aminoácidos cargados los que permiten que se produzca una salinización selectiva.
En un entorno acuoso con una fuerza iónica elevada, las moléculas de agua rodean las cargas de los iones y las proteínas.
A partir de una determinada fuerza iónica, las moléculas de agua ya no son capaces de soportar las cargas de los iones y las proteínas.
Al estar el agua tan «ocupada» en la disolución de los iones en estas soluciones, son menos capaces de disolver los compuestos orgánicos.
Como consecuencia, algunas moléculas pierden solubilidad, se agrupan y precipitan. La selección de la sal y de su concentración permite aprovechar las diferencias de solubilidad entre biomoléculas.
Salting out y serie de Hofmeister
El salting out puede ser una poderosa herramienta para separar clases de proteínas que varían en tamaño, carga y superficie, entre otras características.
Un método para controlar la precipitación es utilizar los diferentes efectos de varias sales y sus respectivas concentraciones.
La capacidad de una sal para inducir una precipitación selectiva depende de muchas interacciones con el agua y los solutos.
La ordenación de cationes y aniones se denomina serie de Hoffmeister, donde el amonio tiene la mayor capacidad de precipitar otros solutos proteicos.
Según la teoría de Hofmeister, diferentes sales y sus concentraciones pueden ser utilizadas para precipitar selectivamente tus biomoléculas.
Sulfato de amonio
Una de las sales más utilizadas es el sulfato de amonio, que se suele emplear porque los iones producidos en una solución acuosa son muy altos en la serie de Hofmeister, y su interacción con la propia proteína es relativamente baja.
Por su eficacia y baja interacción con las proteínas, el sulfato de amonio destaca como una elección popular para la precipitación selectiva.
| Factor | Importancia en la purificación |
|---|---|
| Tipo de sal | Determina la capacidad de inducir una precipitación selectiva. |
| Concentración de sal | Controla qué moléculas pierden solubilidad y precipitan. |
| Tamaño de la proteína | Puede modificar el enfoque ideal para la precipitación. |
| Carga de la proteína | Influye en las interacciones con el agua y los iones. |
| Estructura de la proteína | Puede determinar la estabilidad y la funcionalidad después del tratamiento. |
Aplicación a la purificación de proteínas
El salting out puede emplearse para fraccionar mezclas complejas de proteínas porque cada proteína puede precipitar a una concentración de sal diferente.
La técnica puede parecer ineficaz si no se controla correctamente la concentración de la sal.
Las variaciones en tamaño, carga y estructura de las proteínas pueden dictar el enfoque ideal para la precipitación.
Una vez precipitada una fracción, es posible separarla de la solución y continuar con otras etapas de purificación.
Problemas frecuentes
- Imprecisión en el aislamiento de proteínas específicas. La técnica puede parecer ineficaz si no se controla correctamente la concentración de la sal.
- Desnaturalización de proteínas. Algunas sales, aunque eficaces, pueden alterar la estructura y funcionalidad de la proteína objetivo.
- Dificultad para precipitar biomoléculas grandes o complejas. Las diferencias en la solubilidad pueden complicar el proceso de purificación.
Cómo mejorar el proceso
- Controla la concentración de sal. Según la teoría de Hofmeister, diferentes sales y sus concentraciones pueden ser utilizadas para precipitar selectivamente tus biomoléculas.
- Opta por sales adecuadas. El sulfato de amonio destaca por su eficacia y baja interacción con las proteínas, haciendo que sea una elección popular.
- Conoce tu proteína. Las variaciones en tamaño, carga y estructura de las proteínas pueden dictar el enfoque ideal para la precipitación.
Salting out de compuestos orgánicos
Las soluciones iónicas saturadas pueden utilizarse para disminuir la solubilidad de los compuestos orgánicos en la capa acuosa, permitiendo que una mayor cantidad de un compuesto se disuelva en la capa orgánica.
Sin embargo, el equilibrio puede favorecer la capa orgánica si todos los lavados acuosos contienen altas concentraciones de iones, por ejemplo, NaHCO3, NaCl o NH4Cl saturados.
Al estar el agua tan «ocupada» en la disolución de los iones en estas soluciones, son menos capaces de disolver los compuestos orgánicos.
Este fenómeno es bastante general y se emplea como método de purificación por extracción: la adición de sal reduce la solubilidad en agua de las moléculas orgánicas, de modo que estas se separan como una segunda fase líquida.
Por supuesto, la separación es solo parcial y las dos fases líquidas inmiscibles contienen los tres componentes, si bien una fase (α) es más rica en agua y sal y la otra fase (β) es más rica en propan-2-ol, aunque también contiene agua y sal.
Las dos fases líquidas son transparentes.
Ejemplo con colorante alimentario y acetato de etilo
La figura 2 muestra cómo la salmuera afecta a la partición del colorante alimentario rojo en acetato de etilo y en soluciones acuosas.
La figura 2b muestra la capa de agua que contiene el colorante después de agitarla con una porción de acetato de etilo.
La capa orgánica sólo tiene un color rosa muy tenue, lo que significa que se ha disuelto poco tinte.
La figura 2c muestra la adición de una gota de colorante alimentario rojo a una solución de salmuera, y el colorante no parece mezclarse con la salmuera en absoluto.
La figura 2d muestra la capa de salmuera que contiene el colorante después de agitarla con una porción de acetato de etilo.
Las moléculas polares del colorante son mucho menos solubles en la solución de salmuera que en el agua pura: se han «salting out».
Separación de agua y propan-2-ol
Se muestra que la adición de NaCl a una mezcla líquida de dos componentes miscibles, agua y propan-2-ol, hace que dejen de ser miscibles y se formen dos fases líquidas ternarias, una acuosa rica en sal y la otra orgánica rica en alcohol.
Este fenómeno se conoce como expulsión salina, o salting out, porque parece que la adición de la sal expulsa al propan-2-ol del «agua salada» y los hace líquidos inmiscibles.
Agua y propan-2-ol son completamente miscibles a temperatura ambiente, pues pueden formar enlaces por puentes de hidrógeno.
De hecho, su entalpía de mezcla es negativa para una fracción molar de agua superior al 50 %, lo que indica que esta mezcla es muy estable porque está favorecida entálpicamente y entrópicamente.
Ahora bien, la adición de una suficiente cantidad de NaCl puede hacer que esa mezcla se vuelva inestable y que el estado de equilibrio del sistema tenga dos fases líquidas.
Si la cantidad de sal es mayor, puede haber una fase líquida y otra sólida o dos fases líquidas y una sólida; la fase sólida aparece cuando se supera el límite de solubilidad de la sal.
Explicación molecular
Cuando la fracción molar de agua es superior al 50 %, su interacción con el propan-2-ol está favorecida entálpicamente por la formación de enlaces por puentes de hidrógeno.
La mezcla del agua con un electrólito como NaCl también está favorecida entálpicamente.
Las moléculas de agua en una disolución iónica tienden a formar capas de hidratación compactas alrededor de los iones.
La intensa interacción atractiva ion-dipolo hace que el agua prefiera estar en una fase líquida rica en sal.
Como las moléculas de agua que rodean los iones no están disponibles para rodear a las moléculas de alcohol resulta que, cuando la fracción de agua no es muy grande, la minimización de la energía libre se consigue con dos fases líquidas.
Es decir, la inestabilidad aparece cuando no hay bastante agua para solvatar tanto a los iones como a las moléculas de isopropanol.
Si se añade más agua, puede volver a formarse una única fase.
Composición de una mezcla de demostración
En la mezcla contenida en la botella la composición media corresponde a las fracciones másicas 10.0 % NaCl, 52.0 % agua y 38.0 % propan-2-ol, la cual está en la región de inmiscibilidad líquido-líquido.
Las correspondientes fracciones molares son 4.63 % NaCl, 78.23 % agua y 17.14 % propan-2-ol.
La botella vino con 84.7 g de NaCl añadimos 440.5 mL de agua destilada y 409.5 mL de propan-2-ol puro.
Salting out y equilibrio de fases
El estudio de la región de miscibilidad líquido-líquido no solo ayuda a entender el equilibrio de fases sino también los fenómenos críticos.
En el Laboratorio de Termodinámica se dispone de prácticas para estudiar los equilibrio de aguaetanol y agua-fenol.
Sabemos que agua y etanol son completamente miscibles mientras que agua y fenol tienen una región de inmiscibilidad con una temperatura crítica superior de 68 ºC.
Esta región de inmiscibilidad se ensancha, y la temperatura crítica aumenta, si añadimos un poco de NaCl, digamos un 2 % en masa.
Es decir, las solubilidades del agua en fenol y del fenol en agua se reducen al añadir sal.
Para ampliar los conocimientos sobre miscibilidad resulta interesante acabar planteando la pregunta: ¿cuántas fases líquidas inmiscibles podemos tener simultáneamente en un recipiente?
Pocos estudiantes anticiparán que se pueden tener hasta 10, como se ilustra en el frontispicio del clásico de J. L. Hildebrand y R. L. Scott, Regular Solutions, publicado por Prentice-Hall en Englewood Cliffs en 1962.
<動画>Salting out en la purificación de ADN y ARN
El salting out también se relaciona con procedimientos de purificación de ácidos nucleicos, aunque no todos los métodos de extracción descritos se basan en el mismo mecanismo.
La extracción mediante columnas se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos a la membrana de sílice en presencia de sales caotrópicas que vienen en pequeñas columnas.
Este kit está designado para una rápida purificación de ADN genómico puro a partir de sangre total, suero, plasma, fluidos corporales y “spots” de sangre seca utilizando Microspin columnas con membrana de sílica a la cual se une selectivamente el ADN.
Este kit está optimizado para ser un método rápido de extracción de ADN a partir tejidos embebidos en parafina y fijados con formalina, FFPE.
Purificación de ADN a partir de saliva
Las muestras de saliva se recogen escupiendo dentro del embudo de recolección que se ha ensamblado con el tubo de recolección.
Después de recoger 2 ml de saliva, el contenido de la solución de preservación de saliva se añade y se mezcla con la saliva recogida.
Brevemente, se procesan 400 ml de saliva conservada lisando las células con el Tampón de lisis y proteinasa K mediante incubación a 55 ºC durante 20 minutos.
Después de una centrifugación, se ajustan las condiciones de unión a la membrana de la columna añadiendo etanol y el lisado se añade a la MicroSPin columna.
El ADN unido a la columna se somete a 2 pasos de lavados para eliminar los inhibidores.
En otro procedimiento, las muestras de saliva se recogen escupiendo dentro del embudo de recolección que se ha ensamblado con el tubo de recolección.
Después de recoger 1 ml de saliva, el contenido de la solución de preservación de saliva se añade y se mezcla con la saliva recogida.
Extracción de ADN bacteriano y ARN total
El objetivo de este experimento es introducir los principios de la extracción de ADN cromosómico a partir de células bacterianas de E. coli.
El objetivo de este experimento es introducir los principios de la extracción de ADN plasmídico a partir de células bacterianas.
El proceso incluye una lisis celular con proteinasa K seguida de una precipitación de las proteínas y parte del ADN genómico.
Posteriormente, mediante una precipitación con isopropanol, se obtiene el ARN total, que finalmente se rehidrata.
Estas etapas muestran que la precipitación con sales, alcoholes y otros reactivos puede formar parte de protocolos de purificación diferentes, por lo que es importante distinguir la precipitación por alta fuerza iónica de la adsorción a sílice y de la precipitación con isopropanol.
Requisitos de una práctica de laboratorio
Esta práctica constituye la introducción a la Biología Molecular.
Para la realización de esta práctica es necesario que el laboratorio disponga de micropipetas de 20-200 microlitros y micropipetas de 100-1000 microlitros y sus respectivas puntas.
La elección de la estrategia depende del tipo de biomolécula, de la composición de la muestra y del grado de pureza requerido.
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