El agua destilada se utiliza en parasitología como componente de diferentes reactivos, soluciones de trabajo y procedimientos de lavado. Su uso permite preparar colorantes, diluir soluciones concentradas y enjuagar las preparaciones sin incorporar sales u otras sustancias que puedan alterar el resultado microscópico.
Sin embargo, el agua destilada por sí sola no sustituye a una tinción ni constituye necesariamente un medio de diagnóstico. La elección del procedimiento depende del tipo de parásito, la muestra disponible y el objetivo del examen. La tinción de estructuras parasitarias puede ser efímera o permanente. La elección de la técnica está en función del objetivo que se pretenda y de la estructura parasitaria por procesar.
¿Qué función cumple el agua destilada?
El agua destilada se emplea para preparar soluciones, diluir reactivos y lavar cuidadosamente las laminillas después de determinadas tinciones. En comparación con el agua de composición desconocida, permite reducir la presencia de minerales que podrían formar precipitados, modificar el color de los reactivos o producir artefactos en la preparación.
En la tinción de Giemsa, por ejemplo, las laminillas se lavan cuidadosamente con amortiguador de fosfatos (PBS 1X) y después con agua destilada. En la tinción tricrómica de Gomori-Wheatley, el agua destilada forma parte de la solución concentrada del colorante. También se utiliza para preparar soluciones de Lugol, tionina y verde de malaquita.
Agua destilada en las principales técnicas parasitológicas
Tinción de Giemsa
Una tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie con el objetivo de mejorar el contraste en la imagen vista en el microscopio.
Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
En el campo de la parasitología, la tinción de Giemsa ha permitido hacer el diagnóstico de enfermedades parasitarias tales como la malaria, el mal de Chagas y la leishmaniasis.
Con esta tinción los núcleos de los parásitos se tiñen de rojo brillante y el citoplasma de color azul. Es útil para identificar Plasmodium, Babesia, Trypanosoma, microfilarias de Onchocerca, Trichomonas, Giardia, etc.
En los parásitos Plasmodium sp. y Trypanosoma cruzi pueden visualizarse en sangre periférica de los pacientes infectados, los mismos pueden encontrarse en diversos estadios según la fase en la que esté la enfermedad. Principalmente es de sangre periférica y en casos de leishmaniasis cutánea puede diagnosticarse al evaluar muestras de biopsias de piel teñidas con Giemsa, donde se encuentra el parásito.
Procedimiento:
- Hacer un frotis en un portaobjetos y fijar con metanol durante un minuto.
- Introducir las laminillas en la solución de trabajo durante 20 a 30 minutos.
- Lavar cuidadosamente con amortiguador de fosfatos (PBS 1X) y después con agua destilada.
- Escurrir y secar a temperatura ambiente.
- Montar con resina Entellan.
- Observar al microscopio con aceite de inmersión.
La tinción de Giemsa se recomienda más para el diagnóstico parasitológico de leishmaniasis, de muestras cutáneas.
En una preparación permanente pueden observarse los detalles de un frotis sanguíneo teñido con la coloración de Giemsa, incluido el color de los eritrocitos, del leucocito y de los trofozoítos maduros de Plasmodium vivax dentro de sendos eritrocitos (100×). También pueden observarse trofozoítos de Giardia intestinalis teñidos con Giemsa.
Tinción tricrómica de Gomori-Wheatley
Al principio, la tinción de Gomori se utilizó en tejidos y Wheatley la usó en parásitos; este método es más rápido que el de hematoxilina férrica. Se usa para la coloración de trofozoítos y quistes de protozoarios intestinales, en donde se pueden ver algunos detalles del citoplasma y el núcleo.
Se utilizan heces frescas o fijadas en solución fijadora de alcohol polivinílico (PVA) o preservadas con la solución de acetato de sodio-ácido acético-formaldehído (SAF). Se realiza un frotis fino y se deja secar al aire o al calor a 60 °C.
Solución concentrada:
- Cromotropo 2R: 0.6 g.
- Verde brillante SF: 0.3 g.
- Ácido fosfotúngstico: 0.7 g.
- Ácido acético: 1.0 ml.
- Agua destilada: 100.0 ml.
- Xileno.
Los reactivos secos son colocados en un frasco, se añade el ácido acético, se mezcla y debe dejarse reposar durante 30 minutos. Luego se agrega el agua y se mezcla. Esta solución puede durar varios años.
Procedimiento:
- Para frotis preservados en PVA, sumergirlos en jarra de Coplin con etanol al 70 % más yodo durante 10 minutos. En caso de otros preservadores, seguir las instrucciones del fabricante.
- No se realiza el paso del yodo en muestras que contengan cloruro de mercurio como preservante.
- En una laminilla hacer un frotis y emulsionarlo con solución salina isotónica; es necesario que la capa quede delgada.
- Antes de que las heces se sequen, se fija con Schaudinn durante 60 minutos; se pueden dejar toda la noche en el fijador.
- Para eliminar el exceso de cloruro de mercurio del fijador de Schaudinn, las laminillas son colocadas en alcohol al 70 %-yodo durante un minuto.
- Se lavan dos veces con etanol al 70 %, durante un minuto.
- Las laminillas son colocadas en la solución concentrada de cinco a 10 minutos.
- Se transfieren a etanol al 90 % con 1 % de ácido acético durante 10 a 15 segundos.
- Se sumergen dos veces en etanol absoluto.
- Se ponen en etanol absoluto durante 30 segundos.
- Se meten en xileno durante un minuto.
- Las preparaciones se cubren con resina o bálsamo de Canadá, se les coloca un cubreobjetos del número 1 y se dejan secar.
Los protozoarios adquieren diferentes tonalidades. El fondo se ve sobre todo rojo o verde, en tanto que los protozoarios toman un color más neutro, casi siempre gris o verde pálido. Los cuerpos cromatoides y eritrocitos toman tanto el color rojo como el colorante verde, con lo que se genera un fuerte contraste en el citoplasma; por lo regular los elementos nucleares se tiñen de un color más oscuro.
Una preparación permanente teñida con tricrómica de Gomori-Wheatley puede mostrar la coloración que adquieren las arenillas hidatídicas.
Tinción tricrómica para heces
En general, se reconoce que las películas fecales teñidas son el medio más productivo de examen de las heces en busca de protozoos intestinales. El frotis teñido permanente facilita la detección e identificación de quistes y trofozoítos y proporciona un registro permanente de los protozoos encontrados.
En el frotis teñido a menudo se observan pequeños protozoos que no se detectan en los exámenes de montaje en húmedo, de muestras concentradas o no concentradas. La técnica Wheatley Trichrome para muestras fecales es una modificación del procedimiento de tinción original de Gomori para tejidos.
Es un procedimiento rápido y simple, que produce frotis uniformemente bien teñidos de protozoos intestinales, células humanas, levadura y material de artefactos.
Las muestras suelen consistir en heces frescas o heces fijadas en alcohol polivinílico (PVA) untadas en portaobjetos de microscopio que se dejan secar al aire o secar en un portaobjetos más cálido a 60 °C. También se pueden utilizar heces conservadas en acetato de sodio-ácido acético-formalina (SAF) o algunos de los fijadores de un vial.
Reactivos:
- Etanol al 70 % más yodo.
- Etanol al 70 %.
- Tinte tricrómico.
- Etanol ácido al 90 %.
- Etanol al 95 %.
- Etanol al 100 %.
- Xileno o sustituto de xileno.
Para preparar el etanol al 70 % más yodo, se agregan cristales de yodo a alcohol al 70 % hasta obtener una solución oscura. Para usar, se diluye el caldo con alcohol al 70 % hasta obtener un color marrón rojizo oscuro o un color de té fuerte.
Procedimiento:
- Para frotis de PVA, colocar el portaobjetos en etanol al 70 % más yodo durante 10 minutos.
- Para otros fijadores, seguir las instrucciones del fabricante.
- Omitir el paso del yodo para conservantes que no contienen cloruro de mercurio.
- Colocar el portaobjetos en etanol al 70 % durante 5 minutos.
- Colocar en un segundo etanol al 70 % durante 3 minutos.
- Colocar en el tinte Trichrome durante 10 minutos.
- Desteñir en etanol al 90 % más ácido acético durante 1 a 3 segundos.
- Enjuagar varias veces con etanol al 100 %.
- Colocar en dos cambios de etanol al 100 % durante 3 minutos cada uno.
- Colocar en dos cambios de xileno o sustituto de xileno durante 10 minutos.
- Montar con cubreobjetos utilizando medio de montaje.
- Examinar el frotis microscópicamente utilizando el objetivo de 100 ×.
- Examinar al menos 200 a 300 campos de inmersión en aceite.
Tinción de Lugol
La tinción de Lugol es una de las aplicaciones más directas del agua destilada en el examen parasitológico de heces. Es útil para colorear el glucógeno y visualizar los núcleos en los trofozoítos, quistes y ooquistes de protozoarios, puesto que estos adquieren una coloración marrón, excepto los de Cryptosporidium spp., que no se tiñen, diferencia a tener presente.
Es el mejor método para detectar trofozoítos en una amebiasis invasora por Entamoeba histolytica en heces o en otros productos humanos. Sirve para ejecutar cuenta de huevos de algunos helmintos y así estimar la intensidad de la infección.
La muestra consiste en heces frescas recolectadas en un frasco de vidrio, plástico o cartón, de boca ancha, con tapadera y correctamente etiquetado con la identificación del paciente.
Solución concentrada:
- Yoduro de potasio: 10.0 g.
- Cristales de yodo: 5.0 g.
- Agua destilada: 100.0 ml.
Solución de trabajo:
- Solución concentrada: 5.0 ml.
- Agua destilada: 15.0 ml.
Cuando se prepara la solución de trabajo se debe mantener la relación 1:3 de solución concentrada y agua. Debe almacenarse en frascos ámbar y evitar el exceso de luz porque el yodo reacciona con la luz y pierde su color.
El procedimiento consiste en colocar la muestra sobre un portaobjetos, emulsionarla con una gota de Lugol, cubrirla con un cubreobjetos y observarla al microscopio con los objetivos de 10× y 40×.
La preparación con Lugol es efímera y puede mostrar formas vacuoladas de Blastocystis spp. teñidas con Lugol.
Tinción de tionina
El citoplasma de los protozoarios se tiñe de color rojo-azulado, por lo que se obtiene una mejor diferenciación de los elementos parasitarios y sus estructuras internas.
La muestra consiste en heces frescas recolectadas en un frasco de vidrio, plástico o cartón, de boca ancha, con tapadera y correctamente etiquetado con la identificación del paciente.
Reactivos:
- Tionina: 0,5 g.
- Agua destilada: 200 mL.
- Hidróxido de sodio: 50 mL.
- Etanol 90°: 250 mL.
Procedimiento: Se mezcla una gota del sedimento del enriquecimiento con dos gotas de tionina preparada. Se cubre con laminilla y se espera 5 minutos para que actúe el colorante.
Tinción cristal violeta-safranina
Esta técnica se ideó en Chile en los años 90 y fue rescatada por el ISP para su utilización en laboratorio dado a la buena resolución que entrega de las estructuras parasitarias.
La muestra consiste en heces frescas recolectadas en un frasco de vidrio, plástico o cartón, de boca ancha, con tapadera y correctamente etiquetado con la identificación del paciente.
Solución A, estable en el tiempo:
- Cristal violeta: 1 gr.
- Etanol: 6 ml.
- Suero fisiológico: 494 ml.
Disolver, mezclar bien y filtrar. Guardar en frasco oscuro.
Solución B, con duración de 3 meses a temperatura ambiente:
- Safranina: 0,25 gr.
- Etanol: 10 ml.
- Suero fisiológico: 490 ml.
Disolver, mezclar bien y filtrar. Guardar en frasco oscuro.
Procedimiento: Mezclar 4 partes de solución A con 10 partes de solución B.
Tinción ácido-rápido modificada
Esta técnica es útil para la identificación de ooquistes de las especies de coccidios (Cryptosporidium, Cystoisospora y Cyclospora), que pueden ser difíciles de detectar con tinciones de rutina como el tricrómico.
Se puede utilizar sedimento concentrado de heces frescas o conservadas en formalina. También se pueden teñir otros tipos de muestras clínicas, como líquido duodenal, bilis, muestras pulmonares, esputo inducido, lavado bronquial y biopsias.
Reactivos:
- Metanol absoluto.
- Alcohol ácido: 10 ml de ácido sulfúrico más 90 ml de etanol absoluto.
- Carbol fucsina de Kinyoun.
- Verde malaquita al 3 %: disolver 3 g de verde malaquita en 100 ml de agua destilada.
Procedimiento:
- Preparar un frotis con 1 a 2 gotas de muestra en el portaobjetos y secar en un calentador de portaobjetos a 60 °C hasta que seque.
- Fijar con metanol absoluto durante 30 segundos.
- Teñir con carbol fucsina de Kinyoun durante un minuto.
- Enjuagar brevemente con agua destilada y escurrir.
- Eliminar con alcohol ácido durante 2 minutos.
- Enjuagar con agua destilada y escurrir.
- Contrateñir con verde malaquita durante 2 minutos.
- Enjuagar brevemente con agua destilada y escurrir.
- Secar en un calentador de portaobjetos a 60 °C durante unos 5 minutos.
- Montar con un cubreobjetos usando el medio de montaje deseado.
- Examinar de 200 a 300 campos con objetivos de 40× o más.
- Para confirmar la morfología interna, utilizar un objetivo de inmersión en aceite de 100×.
Tinción con técnica de safranina modificada
La técnica se utiliza para detectar especies de Cyclospora, Cryptosporidia y Cystoisospora. Los ooquistes de Cyclospora en muestras clínicas se demuestran de forma rutinaria mediante tinción acidorresistente modificada en frío.
Sin embargo, con esa técnica, los ooquistes se tiñen de forma variable, desde que no se tiñen hasta que se tiñen por completo, lo que conduce a una posible identificación errónea. La técnica de safranina modificada produce una tinción más uniforme de estos ooquistes.
Se puede utilizar sedimento concentrado de heces frescas o conservadas en formalina. También pueden teñirse otros tipos de muestras clínicas, como el líquido duodenal.
Reactivos:
- Alcohol ácido, compuesto por 3 % de HCl en metanol.
- Tinción de safranina, disponible en kits de tinción de Gram.
- Verde de malaquita al 3 %: disolver 3 g de verde de malaquita en 100 ml de agua destilada.
Procedimiento:
- Preparar un frotis fino en el portaobjetos y secarlo en un calentador de portaobjetos.
- Fijar en alcohol ácido durante 5 minutos.
- Enjuagar con agua destilada.
- Colocar en safranina hirviendo durante 1 minuto.
- Enjuagar con agua destilada.
- Contrateñir con verde malaquita durante 1 minuto.
- Enjuagar brevemente con agua destilada.
- Secar el portaobjetos y montarlo con un cubreobjetos utilizando el medio de montaje deseado.
Tinción con cromótropos
Este método de tinción se desarrolló en los CDC utilizando varios componentes del método de tinción tricrómica para diferenciar las esporas de microsporidios de los elementos fecales de fondo.
Se prepara un frotis fino usando aproximadamente 10 µl de suspensión de heces fecales fijadas con formalina al 10 %, no concentradas, en un portaobjetos de vidrio. También se pueden usar concentrados de formalina, pero el número de organismos será esencialmente el mismo que antes de la concentración.
Se fija con calor en un calentador de portaobjetos a 60 °C hasta que esté completamente seco, durante 5-10 minutos.
Reactivos:
- Metanol absoluto.
- Mancha de cromótropo.
- Alcohol ácido.
- Etanol al 95 %.
- Etanol al 100 %.
- Xileno o sustituto de xileno.
Procedimiento:
- Fijar el frotis en metanol absoluto durante 5 minutos.
- Colocar en tinte cromótropo durante 90 minutos.
- Eliminar en alcohol ácido durante solo 1 a 3 segundos.
- Enjuagar en etanol al 95 % por inmersión.
- Colocar en dos cambios de etanol al 100 % durante 3 minutos cada uno.
- Colocar dos cambios de xileno o sustituto de xileno durante 10 minutos cada uno.
- Drenar el portaobjetos y montarlo con un cubreobjetos utilizando medios de montaje.
- Examinar el frotis después del secado utilizando al menos una inmersión objetiva en aceite de 100× o más.
- Examinar al menos 200 a 300 campos de inmersión en aceite.
Tinción con blanco de calcoflúor
Esta técnica quimiofluorescente es útil para la detección de microsporidios, Acanthamoeba spp., Pneumocystis jiroveci y Dirofilaria spp.
Los agentes quimiofluorescentes, como Calcofluor, Fungi-Fluor o Uvitex 2B, también pueden utilizarse para resaltar estructuras parasitarias y aumentar el contraste en determinadas preparaciones microscópicas.
Preparación del agua destilada y soluciones de uso frecuente
Lugol para el examen directo
El Lugol se utiliza en el examen directo para la tinción de muestras fecales en fresco.
En 100 mL de agua destilada se disuelven 5 g de yodo metálico y 10 g de yoduro potásico. Para su preparación, se disuelve el yoduro de potasio en agua, se añade el yodo metálico y finalmente el resto del agua.
La solución debe protegerse de la luz. Su estabilidad máxima es de un mes.
Formalina al 10 %
La formalina al 10 % es una solución fijadora que ayuda a conservar la muestra fecal y permite transportarla, almacenarla y manipularla sin peligro, ya que los parásitos pierden su capacidad infectiva.
En 10 mL de formaldehído comercial, con una pureza de 35-40 %, se añaden 90 mL de agua destilada.
Verde de malaquita al 3 %
Para preparar el verde de malaquita al 3 %, se disuelven 3 g de verde de malaquita en 100 mL de agua destilada. La solución se almacena a temperatura ambiente.
Solución concentrada de Gomori-Wheatley
La solución concentrada de la tinción tricrómica se prepara con cromotropo 2R, verde brillante SF, ácido fosfotúngstico, ácido acético y agua destilada.
| Componente | Cantidad |
|---|---|
| Cromotropo 2R | 0.6 g |
| Verde brillante SF | 0.3 g |
| Ácido fosfotúngstico | 0.7 g |
| Ácido acético | 1.0 ml |
| Agua destilada | 100.0 ml |
Agua destilada en el lavado de portaobjetos
El agua destilada se utiliza principalmente después de aplicar un colorante o un agente de contraste. El lavado debe realizarse con cuidado, porque un enjuague demasiado intenso puede retirar parte de la tinción o desprender el frotis.
En la tinción ácido-rápido modificada, el portaobjetos se enjuaga brevemente con agua destilada después de la carbol fucsina de Kinyoun, después del alcohol ácido y después del verde de malaquita.
En la técnica de safranina modificada, se utiliza agua destilada después del alcohol ácido, después de la safranina hirviendo y después del verde de malaquita.
En la tinción de Giemsa, el lavado final se realiza después del amortiguador de fosfatos y antes del secado a temperatura ambiente.
Examen directo de muestras fecales
Para el examen directo se emplean heces frescas recolectadas en un frasco de vidrio, plástico o cartón, de boca ancha, con tapadera y correctamente etiquetado con la identificación del paciente.
La muestra puede observarse sin colorante o emulsionarse con una gota de Lugol. El procedimiento con Lugol consiste en colocar la muestra sobre un portaobjetos, emulsionarla con una gota de Lugol, cubrirla con un cubreobjetos y observarla al microscopio con los objetivos de 10× y 40×.
La tinción de Lugol permite colorear el glucógeno y visualizar los núcleos en trofozoítos, quistes y ooquistes de protozoarios. Los elementos adquieren una coloración marrón, excepto los de Cryptosporidium spp., que no se tiñen.
El montaje húmedo es una preparación efímera, mientras que los frotis permanentes teñidos facilitan la detección e identificación de quistes y trofozoítos y proporcionan un registro permanente de los protozoos encontrados.
Selección de la técnica según el objetivo
| Objetivo | Técnica relacionada | Uso principal |
|---|---|---|
| Colorear glucógeno y visualizar núcleos | Lugol | Trofozoítos, quistes, ooquistes y algunos huevos de helmintos |
| Resaltar núcleos y citoplasma en sangre o biopsias | Giemsa | Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania y otros parásitos |
| Identificar protozoos intestinales en preparaciones permanentes | Tricrómica de Gomori-Wheatley | Trofozoítos y quistes |
| Identificar ooquistes de coccidios | Ácido-rápido modificado | Cryptosporidium, Cystoisospora y Cyclospora |
| Obtener una tinción uniforme de ooquistes | Safranina modificada | Cyclospora, Cryptosporidia y Cystoisospora |
| Diferenciar esporas de microsporidios | Cromótropos | Esporas frente a elementos fecales de fondo |
| Detectar estructuras quimiofluorescentes | Blanco de calcoflúor | Microsporidios, Acanthamoeba, Pneumocystis jiroveci y Dirofilaria |
Precauciones para obtener preparaciones útiles
- Utilizar agua destilada para preparar las soluciones indicadas y para los lavados establecidos en cada protocolo.
- Proteger de la luz las soluciones que contienen yodo, especialmente el Lugol.
- Utilizar frascos ámbar cuando el protocolo indique protección frente a la luz.
- Respetar las concentraciones, los tiempos de exposición y las temperaturas de cada técnica.
- Evitar que el frotis fecal quede demasiado grueso, porque es necesario que la capa quede delgada.
- Etiquetar correctamente las muestras fecales desde el momento de la recolección.
- Utilizar fijadores y colorantes siguiendo las instrucciones del procedimiento correspondiente.
- En las preparaciones permanentes, montar el portaobjetos con resina, bálsamo de Canadá u otro medio indicado.
- Observar con aceite de inmersión cuando el protocolo lo requiera.
- Examinar al menos 200 a 300 campos de inmersión en aceite en las técnicas que así lo establecen.
El agua destilada mejora la reproducibilidad de las soluciones y los lavados, pero la observación de parásitos depende también de la calidad de la muestra, la preparación del frotis, la elección del colorante y la experiencia en la interpretación microscópica.
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