Gibco HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) is a zwitterionic organic chemical buffering agent commonly used in cell culture media.
El HEPES es un tampón zwitteriónico ampliamente utilizado para mantener estable el pH de medios de cultivo celular y otras soluciones biológicas. La adición de HEPES resulta especialmente útil cuando el cultivo requiere largos períodos de manipulación fuera de una incubadora de CO2.
Qué es el HEPES
HEPES es el nombre abreviado del ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)etanosulfónico, de fórmula C8H18N2O4S.
Es un compuesto orgánico también denominado ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico, N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) o ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (nombre IUPAC).
Se utiliza ampliamente en bioquímica y biología molecular como agente tampón para mantener el pH fisiológico.
Es un tampón zwitteriónico (tiende a donar o aceptar protones, iones H+, en función del pH de la solución acuosa en la que se encuentra), derivado de la piperazina, clasificado como tampón de Good.
HEPES es una preparación bioquímica importante en la industria bioquímica.
| Propiedad | Dato |
|---|---|
| Nombre común | HEPES |
| Fórmula molecular | C8H18N2O4S |
| Número CAS | 7365-45-9 |
| Masa molar | 238,31 g/mol |
| pKa | 7,48 a 25 °C |
| Rango de pH efectivo | 6,8 a 8,2 |
| Punto de fusión | 234-238 °C |
| Solubilidad en agua | 400 g/L a 20 °C |
Qué significa HEPES Gibco
Gibco HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) is a zwitterionic organic chemical buffering agent commonly used in cell culture media.
La denominación HEPES Gibco identifica el reactivo de HEPES destinado a aplicaciones de cultivo celular y de investigación biológica dentro de la gama Gibco.
Para su uso en investigación o procesos de fabricación posteriores.
Las instalaciones están registradas en la FDA como fabricante de productos sanitarios con certificación según la norma ISO 13485.
La selección concreta debe realizarse consultando el código de producto, la presentación, la concentración y la documentación de calidad correspondiente.
Por qué se utiliza HEPES en cultivos celulares
En los cultivos celulares, el HEPES se utiliza como sustituto del tampón de bicarbonato (entonces a menudo a una concentración de 25 mM) o como tampón adicional al bicarbonato (entonces a menudo a una concentración de 10 - 15 mM).
Los medios tamponados con HEPES se utilizan especialmente cuando la estabilidad del valor del pH en el medio desempeña un papel importante.
Los sistemas de cultivo celular sensibles al valor del pH reciben una amortiguación adicional en el rango de pH 7,2 - 7,6 mediante la adición de HEPES.
Las fluctuaciones en el valor del pH se producen de forma natural a través del metabolismo de las células cultivadas, pero también con los cambios en la concentración de CO2 en la incubadora o en el ambiente circundante.
La adición de HEPES 10 a 25 mM proporciona una mayor capacidad de tamponamiento cuando el cultivo celular requiere largos períodos de manipulación fuera de una incubadora de CO2.
La adición de HEPES a la solución de cultivo puede evitar este problema.
En determinadas condiciones, una solución de cultivo puede volverse rápidamente púrpura cuando la célula es subcultivada y soplada.
Si se cultiva con este medio de cultivo es difícil de sobrevivir, aunque sobreviva, la actividad es también muy baja y la tasa de proliferación es muy lenta.
La función principal del HEPES en este contexto es proporcionar una reserva adicional frente a variaciones de pH durante la manipulación, el transporte temporal o la observación del cultivo fuera del entorno controlado de la incubadora.
HEPES como sustituto o complemento del bicarbonato
El bicarbonato y el CO2 forman un sistema de tamponamiento fundamental en numerosos medios de cultivo celular. El HEPES puede emplearse de dos maneras principales:
- Como sustituto del tampón de bicarbonato, a menudo a una concentración de 25 mM.
- Como complemento del tampón de bicarbonato, a menudo a una concentración de 10 - 15 mM.
Estas dos modalidades no son equivalentes y deben diferenciarse al diseñar o modificar un medio de cultivo.
La elección entre sustituir el bicarbonato o añadir HEPES depende de la formulación del medio, de la atmósfera de CO2, del tiempo que las células permanecerán fuera de la incubadora y de la sensibilidad del modelo celular a los cambios de pH.
pKa y rango de amortiguación
Tiene un pKa de 7,48 a 25 °C, con capacidad tamponante efectiva en un intervalo de pH entre 6,8 a 8,2.
El pKa del HEPES es 7,48 a 25 °C.
El HEPES tiene un rango de pH efectivo de 6,8 a 8,2.
Los sistemas de cultivo celular sensibles al valor del pH reciben una amortiguación adicional en el rango de pH 7,2 - 7,6 mediante la adición de HEPES.
El intervalo efectivo de 6,8 a 8,2 incluye el rango fisiológico utilizado habitualmente en muchos sistemas celulares, aunque el pH de trabajo debe establecerse de acuerdo con el medio y el tipo celular.
Características fisicoquímicas relevantes
La fórmula molecular del HEPES es C8H18N2O4S.
La masa molar del HEPES es 238,31 g/mol.
El peso molecular del HEPES es 238,31 g/mol.
El pH de una solución acuosa de HEPES al 1% está entre 4,7 y 6,0.
El punto de fusión del HEPES está entre 234 y 238°C.
La solubilidad del HEPES en agua es de 400 g/L a 20 °C.
La información de pH de una solución acuosa al 1% no debe confundirse con el pH final de un medio de cultivo formulado, ya que este último depende de la concentración de HEPES, del bicarbonato, del CO2, de otros componentes y del ajuste realizado durante la preparación.
Concentraciones habituales en cultivo celular
La adición de HEPES 10 a 25 mM proporciona una mayor capacidad de tamponamiento cuando el cultivo celular requiere largos períodos de manipulación fuera de una incubadora de CO2.
| Uso del HEPES | Concentración indicada |
|---|---|
| Como sustituto del tampón de bicarbonato | 25 mM |
| Como tampón adicional al bicarbonato | 10 - 15 mM |
| Mayor capacidad de tamponamiento durante manipulaciones prolongadas fuera de la incubadora | 10 a 25 mM |
Las concentraciones indicadas son referencias de uso descritas para medios de cultivo celular; la formulación final debe comprobarse mediante el procedimiento validado para el sistema experimental correspondiente.
Preparación de soluciones de HEPES
También puede prepararse en 100 veces la solución de almacenamiento (l mol/L).
¿Cómo preparar un tampón HEPES 1 mol/L (1 M)?
La preparación de una solución concentrada requiere calcular la cantidad de HEPES a partir de su masa molar de 238,31 g/mol y del volumen final deseado.
La solución resultante debe ajustarse al pH requerido para la aplicación, comprobarse y esterilizarse mediante un procedimiento compatible con el uso previsto.
La preparación, el almacenamiento y la incorporación al medio deben realizarse conforme al protocolo interno y a la documentación técnica del producto.
La solución de cultivo se vuelve rápidamente púrpura cuando la célula es subcultivada y soplada.
Después del almacenamiento durante un cierto período de tiempo, el pH del sistema tampón aumentará con la volatilización del CO2.
Por este motivo, el control del pH debe realizarse en las condiciones reales de preparación y uso, especialmente cuando el medio contiene bicarbonato y se expone a diferentes concentraciones de CO2.
Buenas prácticas al preparar HEPES
- Utilizar agua y recipientes compatibles con la preparación de soluciones para cultivo celular.
- Disolver completamente el compuesto antes del ajuste final de pH.
- Verificar el pH con un equipo calibrado.
- Considerar la interacción entre HEPES, bicarbonato y CO2.
- Controlar las condiciones de almacenamiento y el período transcurrido antes del uso.
- Comprobar la esterilidad y la calidad de la solución antes de incorporarla a un cultivo.
Ventajas del HEPES en medios Gibco
El HEPES se utiliza ampliamente para tamponar muestras biológicas por su capacidad amortiguadora a pH fisiológico y por su menor toxicidad comparado con otros compuestos similares; también como componente de cultivos celulares, por ejemplo, en la industria farmacéutica.
Su naturaleza zwitteriónica y su pKa cercano al pH fisiológico explican su utilidad para reducir las variaciones de pH en sistemas biológicos.
Su uso puede ser particularmente importante durante períodos en los que el cultivo se encuentra fuera de la incubadora de CO2, donde el equilibrio del sistema bicarbonato-CO2 puede modificarse.
La utilidad del HEPES está limitada por el hecho de que no puede utilizarse si se va a realizar una determinación de proteínas después de la Folin.
Además, el sistema de anillos de piperazina forma radicales en determinadas condiciones.
Estas limitaciones deben tenerse en cuenta al seleccionar el tampón para ensayos bioquímicos, análisis de proteínas o experimentos en los que puedan producirse reacciones fotoquímicas o de oxidación.
Aplicaciones del HEPES
El HEPES se utiliza ampliamente para tamponar muestras biológicas por su capacidad amortiguadora a pH fisiológico y por su menor toxicidad comparado con otros compuestos similares; también como componente de cultivos celulares, por ejemplo, en la industria farmacéutica.
En los medios de cultivo celular, se emplea como sustituto del tampón de bicarbonato a una concentración de 25 mM o como complemento del tampón de bicarbonato (concentración 10 - 15 mM).
La adición de 20 mM de HEPES al tampón TBE mejora el comportamiento de la migración de ciertas muestras en el análisis SSCP (polimorfismo de conformación de una sola hebra), con una mayor resolución, especialmente si se desean pequeñas diferencias en las secuencias entre ciertas bandas.
HEPES y modelos celulares
Un tampón adecuado ayuda a conservar las condiciones químicas del entorno celular, pero no sustituye la validación específica del modelo biológico.
Una comparación entre diferentes modelos de hepatocitos humanos revela profundas diferencias en la producción neta de glucosa, la composición lipídica y el metabolismo in vitro.
El cultivo de condrocitos embebidos en hidrogeles de agarosa mantiene el fenotipo condrocítico durante períodos prolongados y permite analizar la respuesta de los condrocitos a fuerzas mecánicas.
Los mecanismos implicados en la transducción de un estímulo mecánico a un proceso fisiológico no están completamente descifrados.
La localización subcelular de proteínas y complejos de adhesión también puede estudiarse mediante tinción de inmunofluorescencia de dos colores.
Por tanto, la elección de HEPES Gibco debe integrarse con la selección del medio, el tipo celular, el diseño experimental y los ensayos posteriores.
Diferencias entre HEPES, HEPPS y HEPPSO
Químicamente, tanto el HEPES, el HEPPS y el HEPPSO son ácidos alcanosulfónicos derivados de la piperazina.
Los tres son tampones zwitteriónicos, clasificados como tampones de Good.
La diferencia está en la longitud de la cadena de carbono entre el grupo amino y el ácido sulfónico, por lo tanto el pKa y el rango de pH efectivo son distintos.
La sustitución de HEPES por otro tampón no debe hacerse únicamente por la similitud del nombre, ya que las propiedades de amortiguación y la compatibilidad con el ensayo pueden variar.
Control de calidad
Test de pirógenos: conforme ensayo.
| Parámetro | Especificación |
|---|---|
| Riqueza (titr.) | min. 99,5 % |
| pH (1 %; H2O) | 4,7 - 6,0 |
| Cenizas sulfatadas | max. 0,1 % |
| Agua | max. 0,5 % |
| Cloruro | max. 0,005 % |
| Sulfato | max. 0,05 % |
| As | max. 0,0001 % |
| Fe | max. 0,0005 % |
La evaluación del reactivo debe incluir la identificación del producto, el código de lote, la fecha de caducidad, las condiciones de almacenamiento y el certificado de análisis aplicable.
Código de producto y compra
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Precauciones de compatibilidad experimental
- La utilidad del HEPES está limitada por el hecho de que no puede utilizarse si se va a realizar una determinación de proteínas después de la Folin.
- El sistema de anillos de piperazina forma radicales en determinadas condiciones.
- El HEPES no elimina la necesidad de controlar el pH del medio.
- El pH final depende de la formulación completa y de las condiciones de CO2.
- La concentración debe seleccionarse según el uso previsto y el protocolo validado.
- La sustitución del bicarbonato por HEPES y la adición de HEPES al bicarbonato son estrategias diferentes.
Identificación química y referencias
El número CAS es un identificador numérico único, que designa una única y específica sustancia.
El número CAS 7365-45-9 corresponde al HEPES, de fórmula C8H18N2O4S.
Es un compuesto orgánico también denominado ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)etanosulfónico, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico, N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) o ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (nombre IUPAC).
Good, N.E. et al. (1966) Biochemistry 5, 467-477. Synthesis and characterization of various 'H+ buffers' for biological research.
Shipman, C. (1969) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 130, 305-310. HEPES as a buffer in cell culture.
Good, N.E. & Izawa, S. (1972) Methods Enzymol. 24, 53-68. Análisis adicional sobre la selección de tampones en la investigación biológica, aquí con énfasis en su idoneidad para el estudio de los procesos fotosintéticos.
Ferguson, W.J. et al. (1980) Anal. Biochem. 104, 300-310. Tampones para amortiguar los iones de hidrógeno para la investigación biológica: síntesis de otros tampones y prueba en cultivo celular, patología vegetal y virología.
Grady, J.K. et al. (1988) Anal. Biochem. 173, 111-115. Radicales de tampones Good.
Liu, Q. & Sommer, S.S. (1998) Biotechniques 25, 50-56.
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