Los kits y reactivos prácticos para la purificación de proteínas permiten aislar proteínas recombinantes mediante interacciones de afinidad selectivas, especialmente con etiquetas de histidina, GST, HaloTag y estreptavidina/biotina. La elección del sistema depende del tamaño de la etiqueta, la fuerza de unión y su efecto sobre la solubilidad y la estabilidad de la proteína.
La etiqueta más utilizada para purificar proteínas recombinantes es la etiqueta de polihistidina. La purificación de proteínas mediante etiquetas His se basa en la afinidad de los residuos de histidina por metales quelados inmovilizados, como el níquel, lo que permite una purificación selectiva de la proteína.
Cómo elegir un sistema de purificación basado en etiquetas de afinidad
Existen numerosas etiquetas de afinidad que pueden utilizarse para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad varían considerablemente en función de su tamaño, la fuerza de unión y el efecto que ejercen sobre la solubilidad y la estabilidad de la proteína.
Los sistemas de purificación deben seleccionarse considerando el tipo de proteína, el organismo o sistema de expresión, el nivel de expresión y la aplicación posterior. Las principales alternativas descritas son las etiquetas His, GST, HaloTag y la interacción estreptavidina/biotina.
| Sistema | Principio de purificación | Características principales |
|---|---|---|
| His o HQ | Afinidad de las histidinas por metales quelados inmovilizados, como el níquel | Etiqueta pequeña, menor inmunogenicidad y sistemas escalables |
| GST | Unión de GST a matrices recubiertas con glutatión inmovilizado | Elución con glutatión soluble; no se recomienda para sistemas eucariotas |
| HaloTag | Captura covalente con cinética de unión rápida | Compatible con E. coli, células de mamífero y sistemas libres de células |
| Estreptavidina/biotina | Interacción de muy alta afinidad entre estreptavidina y biotina | Útil para purificar proteínas biotiniladas y detectar biomoléculas |
Purificación de proteínas con etiquetas His
La etiqueta de polihistidina es la etiqueta más utilizada para purificar proteínas recombinantes. La purificación de proteínas mediante etiquetas His se basa en la afinidad de los residuos de histidina por metales quelados inmovilizados, como el níquel, lo que permite una purificación selectiva de la proteína.
Las etiquetas His ofrecen varias ventajas para la purificación de proteínas. El pequeño tamaño de la etiqueta His hace que sea menos inmunogénica que las etiquetas de mayor tamaño.
Los sistemas HisLink™ son escalables y permiten purificar proteínas marcadas con His o HQ a partir de lisados celulares. Esta opción resulta adecuada cuando se necesita trabajar con diferentes volúmenes de muestra o adaptar el procedimiento a distintas escalas de producción.
Fundamento de la captura por metal quelado
En este sistema, los residuos de histidina de la proteína marcada interactúan con un metal quelado inmovilizado. El níquel es un ejemplo de metal utilizado para capturar selectivamente proteínas con etiqueta His.
La selectividad de esta interacción permite enriquecer la proteína recombinante frente a otros componentes presentes en el lisado celular. Después de la captura, las etapas de lavado ayudan a retirar proteínas y sustancias que no se unen de forma específica.
Purificación con la etiqueta GST
El uso de la etiqueta de afinidad glutatión-S-transferasa, o GST, se basa en la fuerte afinidad de GST por matrices recubiertas con glutatión inmovilizado. Después de la captura y el lavado, la proteína marcada se eluye con glutatión soluble.
Las glutatión-S-transferasas forman una familia de proteínas citosólicas multifuncionales que están presentes de manera endógena en organismos eucariotas, pero normalmente no se encuentran en bacterias. Por este motivo, la purificación basada en GST no se recomienda para sistemas eucariotas, como los de insectos o mamíferos.
Los sistemas MagneGST™ de purificación de proteínas y pull-down están diseñados para purificar proteínas marcadas con GST. El empleo de una matriz compatible con la interacción GST-glutatión permite realizar la captura y posteriormente recuperar la proteína mediante glutatión soluble.
Consideraciones para elegir GST
La presencia natural de glutatión-S-transferasas en organismos eucariotas puede complicar la purificación en esos sistemas. En cambio, el hecho de que estas proteínas normalmente no se encuentren en bacterias favorece el uso de la etiqueta GST en expresiones bacterianas.
La etiqueta GST se utiliza cuando se busca aprovechar una interacción fuerte con glutatión inmovilizado y cuando el sistema de expresión es compatible con las limitaciones de esta estrategia.
Purificación con la tecnología HaloTag
La tecnología HaloTag® es compatible con muchos sistemas de expresión y puede aplicarse a proteínas expresadas en E. coli, células de mamífero y sistemas libres de células. La proteína HaloTag® es una buena etiqueta de afinidad para la purificación y también una buena etiqueta de solubilidad.
La ausencia de un equivalente endógeno de la proteína HaloTag® en células de mamífero y en la mayoría de las células procariotas reduce las posibilidades de interacciones inespecíficas. Esta característica puede favorecer una captura más selectiva de la proteína marcada.
La combinación de captura covalente con una cinética de unión rápida supera las limitaciones basadas en el equilibrio asociadas con las etiquetas de afinidad tradicionales y permite una captura eficiente incluso con niveles de expresión bajos.
Ventajas prácticas de HaloTag
La captura covalente diferencia a HaloTag de los sistemas basados únicamente en interacciones reversibles de equilibrio. La cinética de unión rápida permite realizar una captura eficiente en condiciones en las que la expresión de la proteína es baja.
Además de su función como etiqueta de afinidad, HaloTag® puede actuar como etiqueta de solubilidad. Esta combinación puede ser útil cuando el objetivo es purificar una proteína y, al mismo tiempo, favorecer su comportamiento soluble durante el proceso de expresión y aislamiento.
Purificación mediante estreptavidina y biotina
La fuerza de la interacción entre estreptavidina y biotina se utiliza en numerosas aplicaciones, incluida la detección de diferentes biomoléculas. La estreptavidina presenta una afinidad muy elevada por la biotina.
Las perlas Magne® de estreptavidina se utilizan para purificar anticuerpos biotinilados. La estreptavidina fosfatasa alcalina se utiliza para detectar proteínas biotiniladas.
Este sistema es especialmente útil cuando la proteína o el anticuerpo se encuentra biotinilado y se necesita aprovechar una interacción de alta afinidad para realizar una captura o una detección.
Marcaje de proteínas y reactivos relacionados
El marcaje de proteínas es una técnica muy común y de mucha utilidad en biología molecular. A través del uso de estos reactivos pueden diferenciarse las proteínas para luego poder observarlas mediante técnicas espectroscópicas y microscópicas, separarlas por cromatografía o transfectarlas en un embrión y estudiar procesos de diferenciación celular, entre otras aplicaciones que tienen los marcadores de proteínas en las investigaciones científicas.
El marcaje de proteínas se puede realizar por algún grupo unido a estas, por ejemplo un grupo fosfato, por un residuo de aminoácidos o por su peso molecular, de acuerdo a la necesidad del estudio que se esté llevando a cabo.
Los marcadores de proteínas permiten complementar los procesos de purificación y caracterización. Mientras las etiquetas de afinidad favorecen la captura selectiva, los marcadores de peso molecular y los sistemas fluorescentes ayudan a identificar, localizar o analizar las proteínas obtenidas.
Marcadores de peso molecular para proteínas
Marcador de proteínas de bajo rango de peso molecular
El marcador de proteínas de bajo peso molecular funciona para proteínas entre 3,5 y 42 kDa. Puede utilizarse en estudios de identificación de nuevas proteínas o péptidos relacionados con enfermedades, permitiendo monitorizar la separación de las proteínas de bajo peso molecular del resto de proteínas.
También puede utilizarse para la separación de proteínas y su posterior caracterización y purificación mediante técnicas estandarizadas. Además de este marcador, se pueden utilizar el de peso molecular medio, Molecular Weight Marker, Middle Range, de 14 - 79 kDa, y el de amplio rango, Molecular Weight Marker, Wide Range, de 6.5 - 180 kDa.
| Marcador | Rango | Aplicación indicada |
|---|---|---|
| Molecular Weight Marker, Low Range | 3.5 - 42 kDa | Separación y análisis de proteínas de bajo peso molecular |
| Molecular Weight Marker, Middle Range | 14 - 79 kDa | Identificación de proteínas de rango molecular medio |
| Molecular Weight Marker, Wide Range | 6.5 - 180 kDa | Análisis de proteínas dentro de un intervalo amplio de tamaños |
WIDE-VIEW TM Prestained Protein Size Marker
El WIDE-VIEW TM Prestained Protein Size Marker es un marcador utilizado en electroforesis para marcar proteínas recombinantes según su tamaño. De esta forma es posible comprobar la eficiencia de la separación o de los procesos de transferencia.
Los marcadores preteñidos permiten seguir visualmente la migración durante la electroforesis y comprobar el desarrollo de las etapas de separación y transferencia.
Acrilamida Phos-tag™ para proteínas fosforiladas
La acrilamida Phos-tag™ permite marcar y separar las proteínas fosforiladas en los residuos de treonina, tirosina y serina. Esta es una herramienta para realizar análisis de proteínas por electroforesis, como en el método convencional de SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio.
La separación resulta más eficiente gracias a la unión de los grupos fosfato al reactivo acrilamida Phos-tag™. Las proteínas se separan dependiendo del grado de fosforilación que tenga cada una.
La acrilamida Phos-tag™ puede utilizarse, por ejemplo, en investigaciones relacionadas con mecanismos de hiperfosforilación. Este reactivo permite analizar diferencias de fosforilación que no necesariamente se distinguen con la misma claridad mediante una electroforesis convencional.
Vectores de expresión y marcadores fluorescentes
Los vectores de expresión marcados permiten seguir proteínas concretas en células vivas o estudiar su localización y comportamiento. Estos sistemas complementan la purificación de proteínas cuando el objetivo incluye observar la distribución intracelular, analizar procesos de transfección o estudiar proteínas estructurales.
Vector pCAG-Ble marcado por un grupo carbonilo
El pCAG-Ble es un vector de expresión para proteínas de fusión, en este caso para el estudio de la bleomicina, antibiótico peptídico de origen natural que se usa como fármaco anticancerígeno.
Haciendo uso de este vector de expresión transitoria se logra el marcaje de células que contengan los genes para la expresión de la proteína de formación de la bleomicina.
pTagBFP-actin
pTagBFP-actin es un vector de expresión de actina marcada con proteína fluorescente azul. Este vector puede utilizarse para el marcaje fluorescente de actina en células vivas.
La actina humana que se encuentra en el citoplasma se une por el carbono terminal de la TagBFP. La actina es una familia de proteínas que ha variado poco con la evolución y es una parte importante de todas las células eucariotas.
La actina tiene entre sus funciones la de ser hidrolasa del ATP. Es una proteína muy utilizada en investigaciones del campo de la genética, y el vector pTagBFP-actin puede utilizarse en experimentos de transfección en células de mamíferos que requieran la expresión de actina.
Además, se ha comprobado que puede propagarse en diferentes líneas celulares de E. coli, como DH5alpha, HB101 y XL1-Blue.
pmKate2-vimentin
El pmKate2-vimentin es un vector de expresión de vimentina, proteína utilizada en investigaciones relacionadas con tumores, células madre y otras muchas aplicaciones, por ser un constituyente fundamental del citoesqueleto de las células.
El gen que codifica para vimentina se utiliza como marcador del cáncer de colon, del adenoma de esófago y de otros tumores. En este caso, el codón mKate2 está optimizado para su expresión en células de mamíferos.
El vector puede aplicarse para transfecciones en E. coli y en muchas líneas celulares de mamíferos con las que se trabaja en inmunohistoquímica. La proteína mKate2 fluoresce en el rojo lejano con gran eficiencia y su banda es fácilmente distinguible de la fluorescencia de base.
La proteína mKate2 tiene baja citotoxicidad y es estable frente a los cambios de pH y la incidencia de la luz. Este marcador puede utilizarse con la proteína verde fluorescente sin que ocurra solapamiento de las bandas.
Por esta razón, en investigación se utiliza cuando en un mismo experimento se quieren observar simultáneamente dos señales de emisión procedentes de diferentes proteínas. También existen vectores de expresión de diferentes proteínas, como la actina, la queratina y la anexina, marcadas con mKate2.
Relación entre purificación, separación y detección
Los sistemas de afinidad permiten capturar proteínas recombinantes o biotiniladas a partir de muestras complejas. Los marcadores de peso molecular permiten verificar el tamaño aparente y la calidad de la separación, mientras que los reactivos fluorescentes y Phos-tag™ aportan información sobre localización, modificación y estado funcional.
La elección del reactivo depende de la pregunta experimental: las etiquetas His se utilizan para una captura selectiva mediante metales quelados; GST para una captura basada en glutatión; HaloTag para una captura covalente rápida y compatible con varios sistemas de expresión; y estreptavidina/biotina para aprovechar una interacción de afinidad muy elevada.
Después de la purificación, los marcadores de peso molecular pueden ayudar a identificar la proteína y comprobar la separación o la transferencia. Cuando el análisis se centra en fosforilación, la acrilamida Phos-tag™ permite separar las proteínas según su grado de fosforilación en residuos de treonina, tirosina y serina.
Clonación de ADN y ADN recombinante | Biología | Khan Academy en Español
tags: #practicos #kits #y #reactivos #de #purificacion
Publicaciones populares:
- Cómo el agua oxigenada interviene en la limpieza sanguínea
- Guía rápida para la tisana depurativa Grano Vita
- Tratamiento de agua de piscina en San Vicente
- Guía paso a paso para cambiar el filtro de gasoil en Ford Kuga
- Filtro de agua para centro de planchado Bomann DBS 778 CB: guía de instalación