Un protocolo de purificación de AAV basado en filtración de flujo tangencial (TFF) y tensioactivos permite eliminar impurezas críticas, preservar mejor la infectividad viral y simplificar las etapas posteriores de procesamiento. La combinación de desoxicolato de sodio al 0,5 % con CHAP al 1 % alcanzó una eliminación del 99,98 % de las proteínas de la célula huésped (HCP) y del 95 % del ADN residual.
El proceso se desarrolló como una alternativa rápida, suave y escalable a los esquemas que dependen de múltiples centrifugaciones, ultracentrifugación en gradientes de cloruro de cesio o yodixanol y cromatografía repetida. El método puede utilizarse como etapa inicial de captura o clarificación dentro de un flujo de purificación de varios pasos, aunque todavía no separa de manera suficiente las cápsides vacías de las partículas completas y presenta una recuperación viral subóptima.
Importancia de la purificación de vectores AAV
Las cápsides del virus adenoasociado (AAV) se han convertido en las favoritas para la administración de genes in vivo gracias a su perfil de seguridad único y su capacidad para proporcionar una expresión génica a largo plazo. El AAV (virus adenoasociado), un pequeño virus muy frecuente en bioproducción, se ve favorecido por su limitada replicación y su reducida inmunogenicidad en seres humanos.
Los vectores AAV se han convertido en herramientas de administración de "estrella" en la terapia génica debido a su alta seguridad, baja inmunogenicidad, capacidad de infectar tanto las células divisorias y no - y la capacidad de la expresión del gen del término largo -}. Con múltiples serotipos de vectores AAV recombinantes utilizados en diversos programas de terapia génica, este campo está experimentando un crecimiento sin precedentes.
La terapia génica se está desarrollando rápidamente, pero su alto costo sigue siendo una barrera importante que evita el acceso más amplio al paciente. Entre los impulsores clave de este costo se encuentra el complejo proceso de producción de los vectores de virus asociados (AAV) adeno -.
La producción de vectores víricos de alta calidad para transferencia génica exige un proceso complejo de biotransformación, que abarca la producción de ADN plasmídico y otros pasos intrincados. Tras la propagación de los virus en las células huésped, para prácticamente todas las aplicaciones es necesario purificar los virus a partir de las células huésped, antes de su uso adicional.
Principales desafíos del procesamiento aguas abajo
Sin embargo, su proceso de producción es complejo, particularmente los pasos de purificación aguas abajo, que generalmente involucran múltiples rondas de centrifugación y cromatografía. Estos métodos son tiempo - consumidor, mano de obra - intensivo, difícil de escalar y costoso.
A escala de laboratorio, la purificación a menudo se basa en el cloruro de cesio o la ultracentrifugación de gradiente de densidad de yodixanol, que es difícil de escalar para la producción industrial. La cromatografía de afinidad se usa cada vez más, pero las bajas condiciones de elución de pH que requiere pueden afectar la infectividad viral.
Por lo tanto, desarrollar un método de purificación AAV simple, eficiente, suave y escalable es fundamental. Achieving high purity and yield during adeno-associated virus (AAV) downstream processing (DSP) requires overcoming several persistent challenges.
- Enriquecer las cápsides llenas frente a las cápsides vacías y parcialmente llenas afecta directamente a la potencia del vector y a la consistencia de la dosis.
- Las impurezas relacionadas con el proceso incluyen proteínas de la célula huésped (HCP), ADN residual y virus adventicios.
- Las impurezas relacionadas con el producto incluyen cápsides vacías, parcialmente llenas y sobrecargadas.
- La variabilidad entre serotipos de AAV y cápsides diseñadas exige estrategias de purificación flexibles.
El TFF convencional tiene una capacidad limitada para eliminar impurezas como las proteínas de las células huésped (HCP) y el ADN durante la purificación de AAV, a menudo dejando los agregados de proteínas. La filtración de flujo tangencial (TFF) es una técnica de separación basada en el tamaño - comúnmente utilizado para concentrar y amortiguar - intercambiar bioproductos.
Fundamento de la filtración de flujo tangencial
En la filtración de flujo tangencial, el material circula de forma paralela a la superficie de la membrana, mientras que las especies suficientemente pequeñas atraviesan la membrana y las partículas de mayor tamaño permanecen en el retenido. Esta configuración se utiliza habitualmente para concentrar productos biológicos y realizar intercambios de tampón.
En el caso de los vectores AAV, la separación por tamaño permite retener las partículas virales mientras se eliminan componentes de menor tamaño. Sin embargo, las proteínas residuales pueden agregarse o interactuar entre sí, formar especies de mayor tamaño y permanecer retenidas junto con el virus.
Por este motivo, el TFF convencional no siempre proporciona una eliminación suficiente de HCP, ADN residual y agregados proteicos. La estrategia combinada con tensioactivos busca modificar esas interacciones sin someter al vector a las condiciones de pH bajo asociadas con algunas etapas de elución cromatográfica.
Principio del protocolo con tensioactivos
Para superar las limitaciones de TFF tradicional, los investigadores Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa y sus colegas de la Universidad de Tokio idearon una estrategia inteligente: el uso de tensioactivos para inhibir la agregación y la interacción de las proteínas de impureza, lo que les permite pasar a través de la membrana de ultrafiltración de TFF (500 KDA Molecular). nm en tamaño).
El objetivo del tratamiento es reducir la asociación entre las proteínas residuales y evitar que los agregados queden atrapados en la membrana junto con los AAV. De este modo, las impurezas pueden atravesar la membrana de ultrafiltración, mientras que las cápsides virales permanecen en la fracción retenida.
El esquema estudiado utiliza dos tensioactivos con propiedades diferentes: el desoxicolato de sodio, de carácter aniónico, y CHAP, de carácter zwitteriónico. La combinación permite actuar sobre poblaciones distintas de proteínas residuales.
| Componente | Tipo | Función en el proceso |
|---|---|---|
| Filtración de flujo tangencial | Separación basada en el tamaño | Concentrar los vectores y facilitar el intercambio de tampón |
| Desoxicolato de sodio | Aniónico | Mejorar la eliminación de proteínas residuales |
| CHAP | Zwitteriónico | Actuar sobre una población diferente de proteínas residuales |
| Membrana de ultrafiltración | 500 KDA Molecular | Retener las partículas AAV y permitir el paso de impurezas acondicionadas |
Selección de tensioactivos
Probaron tres tipos de tensioactivos:
- Non - Ionic:Glucósido de octilo
- Aniónico:Desoxicolato de sodio
- Zwitteriónico:Chapas
El estudio encontró que usar un tensioactivo iónico no - solo era ineficaz. Tanto el desoxicolato de sodio aniónico como el CHAP zwitteriónico mejoraron significativamente la eliminación de proteínas residuales, y se dirigieron a diferentes poblaciones de proteínas.
En última instancia, la combinación de desoxicolato de sodio al 0,5% con un 1% de CHAP produjo resultados notables, eliminando casi por completo las proteínas residuales del huésped. El análisis de la página SDS - mostró solo las tres bandas de proteínas Clear AAV Capsid (VP1/VP2/VP3).
Protocolo operativo de purificación
1. Obtención del material viral
Los métodos de purificación deben adaptarse al origen del material de partida. El método purificó con éxito múltiples serotipos - que incluyen AAV1, AAV5, AAV8 y AAV9-FROM CELUCT SUPERNATANTS.
Para AAV2, que existe principalmente en lisados celulares con alta carga de impureza, se necesita una optimización adicional. Esta diferencia es importante porque los sobrenadantes celulares y los lisados celulares presentan perfiles de impurezas distintos y no deben tratarse como materiales equivalentes durante el desarrollo del proceso.
2. Clarificación inicial
La clarificación debe reducir las partículas celulares y los residuos de mayor tamaño antes de la etapa de ultrafiltración. En los procesos de producción viral, se han descrito operaciones que comprenden hacer crecer células huésped, infectar las células huésped con virus, recoger y lisar las células huésped, concentrar el lisado bruto, cambiar el tampón del lisado bruto, tratar el lisado con nucleasa y purificar adicionalmente el virus usando cromatografía.
La mayoría de los métodos descritos aplican una etapa de tratamiento con nucleasa para degradar las impurezas de ADN. El tratamiento con nucleasa puede integrarse en el flujo de trabajo cuando el material contiene una carga elevada de ADN residual, especialmente si procede de lisados celulares.
3. Acondicionamiento con tensioactivos
El material viral se acondiciona con desoxicolato de sodio al 0,5% y CHAP al 1%. La finalidad de esta etapa es inhibir la agregación y la interacción de las proteínas de impureza antes de la filtración.
El estudio demostró que el desoxicolato de sodio y CHAP deben considerarse conjuntamente, ya que se dirigieron a diferentes poblaciones de proteínas. El uso de un tensioactivo iónico no - solo no produjo una eliminación suficiente de las proteínas residuales.
4. Filtración de flujo tangencial
La mezcla acondicionada se procesa mediante TFF utilizando una membrana de ultrafiltración de 500 KDA Molecular. nm en tamaño). Durante la operación, el vector AAV queda concentrado en el retenido y las especies de impureza acondicionadas atraviesan la membrana.
El TFF también puede utilizarse para concentrar y realizar el intercambio de tampón del producto biológico. La elección de las condiciones operativas debe mantener la integridad de las cápsides y limitar la formación de nuevos agregados.
5. Recuperación y formulación intermedia
Tras la filtración, el retenido contiene el vector concentrado y debe someterse a una recuperación controlada. Las limitaciones actuales incluyen recuperación viral subóptima e incapacidad para separar las cápsides vacías de las partículas virales completas, lo que sugiere que su mejor uso puede ser como una primera captura de paso - en un flujo de trabajo de purificación de pasos múltiple -}.
Por tanto, el material obtenido mediante TFF con tensioactivos puede utilizarse como una fracción de captura inicial antes de incorporar una etapa de pulido cromatográfico, una separación de cápsides o una operación adicional de formulación.
Resultados de pureza y eliminación de impurezas
Eliminación de proteínas de la célula huésped
El nuevo método alcanzó el 99.98% de eliminación de HCP y el 95% de eliminación de ADN, con pureza comparable o excediendo la de la cromatografía de afinidad. Estos resultados muestran que el acondicionamiento con tensioactivos puede resolver una de las principales limitaciones del TFF convencional.
La eliminación de las HCP es especialmente importante porque estas proteínas pueden afectar a la seguridad, la estabilidad, la inmunogenicidad y la consistencia del producto final. La reducción del ADN residual también es necesaria para controlar las impurezas derivadas de las células productoras y de los materiales utilizados durante la fabricación.
Perfil de cápside
El análisis de la página SDS - mostró solo las tres bandas de proteínas Clear AAV Capsid (VP1/VP2/VP3). La presencia de las bandas VP1, VP2 y VP3 es coherente con la detección de las proteínas estructurales principales de la cápside AAV.
La electroforesis SDS-PAGE y la microscopía electrónica de transmisión se utilizaron para evaluar el material purificado. Figura 1. Proceso de purificación de TFF sin tensioactivos;(a) SDS - Page gel electroforesis; (b) Microscopía electrónica de transmisión (TEM).
Figura 1. Proceso de purificación de TFF con tensioactivos;(a) SDS - electroforesis en gel de página; (b) Microscopía electrónica de transmisión (TEM).
Actividad biológica e infectividad
Los experimentos in vitro mostraron que los vectores AAV1 purificaron usando este método infectaron las células HEK293 de manera más eficiente que las purificadas por la cromatografía de afinidad (24.9% frente a 20.8%), lo que indica una mejor preservación de la bioactividad viral.
| Parámetro | Purificación mediante TFF y tensioactivos | Comparación |
|---|---|---|
| Infectividad en células HEK293 | 24.9% | 20.8% para cromatografía de afinidad |
| Eliminación de HCP | 99.98% | Pureza comparable o superior a la cromatografía de afinidad |
| Eliminación de ADN | 95% | Reducción elevada de ADN residual |
| Duración del proceso | 1.5 horas | Flujo de trabajo simplificado |
La mayor infectividad observada sugiere que el procedimiento evita parte del daño asociado con las condiciones de elución de bajo pH. La cromatografía de afinidad puede concentrar selectivamente las partículas AAV, pero las condiciones necesarias para liberar el vector unido deben optimizarse para cada serotipo y pueden afectar a la integridad o a la actividad del producto.
Evaluación de seguridad in vivo
Después de la inyección local de vectores AAV1 purificados en el músculo esquelético del ratón, no se observó una inflamación o daño tisular significativo después de dos semanas, lo que demuestra que la seguridad in vivo sea buena.
Este resultado respalda la compatibilidad biológica del material purificado en las condiciones evaluadas. Sin embargo, la seguridad de un producto AAV debe establecerse mediante un conjunto completo de ensayos de identidad, pureza, potencia, estabilidad, impurezas y respuesta biológica.
Aplicabilidad a diferentes serotipos
El método purificó con éxito múltiples serotipos - que incluyen AAV1, AAV5, AAV8 y AAV9-FROM CELUCT SUPERNATANTS. La capacidad de procesar varios serotipos es relevante porque los programas de terapia génica utilizan cápsides con tropismos, perfiles de inmunogenicidad y características fisicoquímicas diferentes.
Sin embargo, para AAV2, que existe principalmente en lisados celulares con alta carga de impureza, se necesita una optimización adicional. La procedencia del material viral, la carga de proteínas celulares, el contenido de ADN y la tendencia a la agregación pueden modificar el comportamiento del producto durante el TFF.
Ventajas frente a los flujos de purificación convencionales
Este estudio desarrolló un nuevo proceso de purificación AAV simple, rápido (1.5 horas), eficiente y escalable. Al combinar el desoxicolato y los CHAP, abordó con éxito el desafío de la agregación de proteínas residuales durante la purificación de TFF.
- Evitar las duras condiciones de pH bajo, preservar mejor la actividad viral.
- Reducir los pasos de cromatografía, simplificar el flujo de trabajo y ahorrar tiempo y costos.
- Ser fácilmente escalable, adecuado para la producción industrial de escala grande -.
- Proporcionar una nueva estrategia para purificar otras biomacromoléculas como exosomas, otros virus y anticuerpos recombinantes.
La filtración de flujo tangencial puede integrarse en procesos que ya utilizan clarificación, concentración e intercambio de tampón. Su utilización como captura inicial puede reducir la carga sobre las etapas cromatográficas posteriores y facilitar la transición desde el desarrollo de laboratorio hacia escalas mayores.
Los procesos de purificación de AAV aguas abajo suelen integrar una captura basada en afinidad seguida de una etapa de pulido no basada en afinidad y análisis para respaldar la consistencia del proceso y la preparación para la fabricación.
Relación con la cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad se usa cada vez más, pero las bajas condiciones de elución de pH que requiere pueden afectar la infectividad viral. Affinity chromatography selectively concentrates AAV particles while allowing many impurities to flow through. Subsequent polishing steps further refine purity following capture.
Los ligandos de afinidad reconocen epítopos específicos en las superficies de las cápsides AAV, permitiendo la unión selectiva mientras las impurezas no relacionadas atraviesan la columna. La especificidad del ligando puede ser específica de un serotipo al dirigirse a proteínas únicas de su cápside, o puede dirigirse a un epítopo común a muchos serotipos AAV.
Las resinas de cromatografía de afinidad con especificidad amplia para serotipos pueden unirse a una amplia gama de variantes AAV naturales y diseñadas, aunque estas últimas pueden requerir la confirmación de la conservación del epítopo o una optimización adicional del proceso.
La selectividad, el rendimiento y la compatibilidad con las etapas posteriores influyen en la elección de la captura primaria al diseñar un flujo de purificación de AAV. La densidad de carga, el tiempo de residencia y la composición del tampón influyen en el rendimiento de unión y la recuperación, y deben optimizarse conjuntamente.
Etapas de pulido y separación de cápsides
El pulido aborda las impurezas residuales y favorece el enriquecimiento de cápsides AAV completas después de la captura, aunque no existe un método universal. Las condiciones de separación pueden requerir un nuevo desarrollo para cada serotipo o constructo.
La cromatografía de intercambio aniónico (AEX) puede utilizarse para reducir impurezas relacionadas con el proceso y el producto, como las proteínas de la célula huésped y las cápsides vacías. Las condiciones cromatográficas, incluyendo el pH, la conductividad y los excipientes, pueden ajustarse para influir en la eliminación de impurezas y en la separación de cápsides vacías y completas.
We describe a new optimized, scalable and reproducible method based on anion exchange chromatography to obtain high titers of rAAV vectors without empty capsids contamination. The method takes advantage of Q-sepharose matriz to development a scalable procedure.
After the virus harvest from supernatant and lysate cells, virus crude was subjected to anion exchange chromatography with Q-sepharose column. Three different protocols were tested, and the elution peaks were evaluated through qPCR rAAV titration and 260/280 nm ratio determination in order to identified empty capsid-containing fractions.
A 150 mM NH4Ac wash step fallowing by 1 M NaCl elution step generate a a high titer eluted fraction of rAAV with 1.334 260/280 nm ratio. The described method makes rAAV vector purification an easily adapted for a large scale GMP production format to produce empty capsid free rAAV for clinics.
La incapacidad del procedimiento TFF con tensioactivos para separar por completo cápsides vacías y completas no impide su utilidad, pero define su posición en el flujo de trabajo. La etapa debe considerarse principalmente una primera captura o una operación de reducción de impurezas, seguida de una etapa de pulido destinada a los atributos del producto que requieren mayor resolución.
Escalabilidad y fabricación industrial
La ultracentrifugación puede ser útil en la investigación y en la producción a pequeña escala, pero es difícil de escalar para la fabricación industrial. Las columnas de lecho empaquetado ofrecen flexibilidad para volúmenes de fabricación mayores y modelos de escalado establecidos, por lo que son preferibles a enfoques no escalables como la ultracentrifugación cuando los programas avanzan hacia la fabricación cGMP.
La cromatografía de membrana ofrece mayores caudales y tiempos de procesamiento más cortos que las resinas tradicionales de lecho empaquetado y puede acelerar la producción de productos biológicos desde el desarrollo hasta la fabricación. La elección de la resina influye en la capacidad de unión, la capacidad de caudal y la estabilidad química a través de múltiples ciclos.
La densidad de carga, el tiempo de residencia y la estrategia de elución deben mantenerse constantes entre escalas para conservar una pureza y un rendimiento comparables. La estrategia TFF con tensioactivos puede contribuir a reducir la dependencia de varias etapas cromatográficas y a simplificar el flujo de proceso.
Control analítico del producto purificado
La caracterización precisa de AAV es crucial para garantizar la eficacia de las terapias génicas. Visible y partícula subvisible (SVP) El análisis desempeña un papel fundamental en este proceso.
Garantizar la calidad constante de las terapias génicas con AAV depende de la capacidad de caracterizar rápidamente los atributos críticos de calidad (CQA). Esto incluye la medición del título viral, el contenido de la cápside y la agregación, todos los cuales influyen en la potencia, la pureza y la seguridad de los AAV.
Los métodos actuales de caracterización del AAV incluyen la dispersión dinámica de luz (DLS) y la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que se utilizan habitualmente para caracterizar poblaciones de AAV solubles y submicrométricas. Aunque son muy informativas, estas técnicas no proporcionan una visión completa, ya que se centran principalmente en los AAV solubles y estables.
Es igualmente importante estudiar los AAV insolubles e inestables para identificar posibles vulnerabilidades o irregularidades y garantizar su uso seguro y eficaz. Técnicas como el oscurecimiento de la luz (LO) y la imagen de flujo (FI) se utilizan para caracterizar las poblaciones de partículas insolubles en las formulaciones de AAV, proporcionando información sobre especies más grandes y heterogéneas.
Sin embargo, requieren grandes volúmenes de material, pueden ser costosas y llevar mucho tiempo, lo que crea cuellos de botella en el desarrollo y la fabricación de terapias génicas. Los análisis tradicionales de AAV y los ensayos de control de calidad requieren mucho tiempo y pueden no ser adecuados para los plazos de desarrollo rápido de productos.
Métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento
Se están desarrollando nuevos métodos analíticos de AAV rápidos y de alto rendimiento. Ahora se pueden utilizar métodos basados en cromatografía y dispersión de luz para caracterizar estas CQA directamente o en línea, lo que permite la supervisión y el control del proceso en tiempo real.
Los métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento para AAV pueden proporcionar resultados útiles con rapidez, pero su desarrollo e implementación pueden resultar difíciles debido a las cantidades limitadas de muestras y a los efectos de la matriz. A pesar de estos retos, se han logrado avances significativos en el desarrollo de métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento para la caracterización del rAAV, especialmente para tres CQA potenciales: título de cápside, ratio de contenido y contenido de agregados.
- Desarrollo más rápido de productos: los métodos analíticos rápidos pueden ayudar a acelerar el desarrollo de productos al proporcionar información oportuna sobre el rendimiento del proceso y la calidad del producto.
- Reducción de costes: los métodos analíticos rápidos pueden ayudar a reducir los costes al disminuir el tiempo y los recursos necesarios para las pruebas de control de calidad.
- Mejora de la calidad del producto:los métodos analíticos rápidos pueden ayudar a mejorar la calidad del producto al permitir la supervisión y el control del proceso en tiempo real.
Sin embargo, siguen existiendo retos:
- Cantidades limitadas de muestras:la producción de rAAV suele generar solo pequeños volúmenes de producto purificado, lo que puede limitar la cantidad de muestra disponible para el análisis.
- Efectos de matriz: Lapresencia de otras moléculas en la muestra de rAAV, como tampones, ADN o proteínas residuales, o sales iónicas, puede interferir en las mediciones analíticas.
- Desarrollo de métodos:El desarrollo de métodos analíticos rápidos y de alto rendimiento que sean precisos, fiables y reproducibles puede resultar complicado.
Los autores concluyeron que será fundamental desarrollar métodos analíticos de AAV que puedan soportar plazos cortos y un alto rendimiento en el desarrollo de procesos, al tiempo que mantengan la reproducibilidad y la especificidad.
Caracterización de agregados en volúmenes ultrabajos
Caracterizar la agregación y la estabilidad del AAV en volúmenes ultrabajos es fundamental para lograr la pureza del producto y evitar fugas o contaminaciones de ADN. Los avances tecnológicos han abierto nuevas posibilidades en este ámbito, por lo que ahora es posible detectar rápidamente la inestabilidad y caracterizar la agregación del AAV en volúmenes ultrabajos, lo que resulta muy útil para el desarrollo de terapias génicas.
Con la tecnología Side Illumination Membrane Imaging (SIMI) y Fluorescence Membrane Microscopy (FMM) de Aura System, combinada con las capacidades de índice de refracción de BMI, se puede obtener una comprensión más profunda de las muestras para identificar el contenido de proteínas o no proteínas junto con elementos intrínsecos o extrínsecos, algo que los analizadores de partículas tradicionales basados en flujo no podían proporcionar.
A diferencia de la imagen de flujo, que requiere mililitros de muestra, Aura Systems Puede caracterizar rápida y fácilmente vectores virales y otros tipos de terapias génicas con solo 5 µL de muestra. Esto se debe al análisis de muestras mediante microscopía de membrana, que requiere cantidades meniscales y mantiene una eficiencia de muestreo del 100 %.
Aura GT System’s technology also allows for AAV characterization with high throughput (<1 min/sample), quickly revealing insights into their stability. The system helps to ensure that a gene therapy’s most important stability characteristic - its SVP concentration - can be monitored throughout process development and through quality control testing.
Se probó la agregación del vector AAV2 en diversas condiciones de estrés: (a) la concentración de partículas con un diámetro circular equivalente (ECD) ≥ 2 μm y (b) el porcentaje de la membrana cubierta por partículas.
Integración de purificación y análisis
La integración de la purificación con el desarrollo analítico es esencial para tomar decisiones fiables durante el desarrollo del proceso. Un proceso de purificación robusto proporciona material purificado para desarrollar métodos analíticos cualificados, mientras que los análisis respaldan la caracterización del proceso y la toma de decisiones.
La sensibilidad y reproducibilidad del ensayo se ven afectadas en gran medida por la pureza de los estándares utilizados durante el desarrollo analítico. Asimismo, unos ensayos fiables permiten a los científicos del proceso cuantificar las cápsides y las impurezas mientras examinan y optimizan las condiciones del proceso.
Las herramientas analíticas, incluidos los ensayos de determinación del título viral, los kits ELISA, la cuantificación del ADN plasmídico residual y los sistemas de detección de virus, respaldan la caracterización del proceso y el seguimiento de las impurezas durante el desarrollo y la fabricación.
Emplear múltiples métodos analíticos de AAV permite comenzar la selección y el cribado de candidatos mucho antes en el desarrollo, lo que proporciona la confianza necesaria para avanzar hacia la comercialización de una terapia génica.
Limitaciones que deben resolverse
La recuperación viral subóptima es una de las limitaciones actuales del método. Una reducción del rendimiento puede ser aceptable en una primera etapa de captura si se compensa con una mejor eliminación de impurezas y una simplificación global del proceso, pero debe cuantificarse durante la optimización.
Otra limitación es la incapacidad para separar las cápsides vacías de las partículas virales completas. La proporción de cápsides llenas influye directamente en la potencia específica, la dosis administrada y la consistencia entre lotes.
La aplicación a AAV2 requiere una optimización adicional porque este serotipo existe principalmente en lisados celulares con alta carga de impureza. El material procedente de lisados puede necesitar una clarificación, un tratamiento con nucleasa o una etapa de pulido más intensos que el material obtenido de sobrenadantes celulares.
La selección de las condiciones debe realizarse para cada serotipo y constructo. La composición del tampón, la conductividad, el pH, los excipientes, la densidad de carga, el tiempo de residencia y la estrategia de elución pueden afectar a la recuperación, la agregación, la pureza y la integridad de la cápside.
Posición del TFF con tensioactivos dentro del flujo de proceso
El método ofrece una opción atractiva para la producción de vectores AAV aguas abajo porque combina una separación basada en tamaño con un acondicionamiento químico dirigido a las proteínas residuales. Su principal valor se encuentra en reducir la carga de impurezas antes de las etapas de pulido y en evitar parte de las condiciones agresivas de la cromatografía.
Un flujo de trabajo general puede integrar clarificación, tratamiento de nucleasa cuando sea necesario, acondicionamiento con desoxicolato de sodio al 0,5% y CHAP al 1%, TFF con membrana de 500 KDA Molecular. nm en tamaño), concentración e intercambio de tampón, seguido de una etapa de pulido y de análisis de los atributos críticos de calidad.
Los pasos posteriores pueden incluir cromatografía de intercambio aniónico para reducir impurezas relacionadas con el proceso y el producto, así como métodos analíticos para determinar el título viral, el contenido de cápside, la agregación, el ADN residual, las HCP y la proporción de cápsides llenas y vacías.
Este estudio desarrolló un nuevo proceso de purificación AAV simple, rápido (1.5 horas), eficiente y escalable. Al combinar el desoxicolato y los CHAP, abordó con éxito el desafío de la agregación de proteínas residuales durante la purificación de TFF.
2do Seminario Cytiva: Clarificación y filtración tangencial
En conclusión, esta investigación ofrece una nueva opción atractiva para la producción de vectores AAV aguas abajo y tiene el potencial de reducir significativamente el costo de los medicamentos de terapia génica, facilitando su aplicación más amplia.
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