La purificación por HPLC es una forma muy eficaz y eficiente de purificación, basada en la hidrofobicidad del ADN, que permite separar y purificar el ADN cebador y lograr una alta pureza de los fragmentos de ADN. Los oligos de menos de 50 bases de longitud se purifican bien mediante HPLC de fase inversa.
La HPLC resulta especialmente útil cuando se necesita eliminar cebadores truncados, subproductos de síntesis o impurezas estrechamente relacionadas con la secuencia completa. A través de este enfoque de purificación, se eliminan preferiblemente los oligos n-x truncados, que carecen del grupo de protección DMT hidrofóbico en el extremo 5’, y se obtiene una pureza del 90-95% del oligonucleótido dirigido.
Qué es la HPLC y cómo se aplica a los cebadores
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica de separación analítica utilizada para identificar, cuantificar y purificar los componentes de una mezcla. En la HPLC, una fase móvil líquida transporta analitos disueltos a través de una columna rellena con una fase estacionaria a alta presión.
Las diferencias de interacción entre los analitos, la fase estacionaria y la fase móvil hacen que los compuestos se separen a medida que se desplazan por la columna. Detectores como los de UV-Vis, fluorescencia o espectrometría de masas miden los compuestos separados, lo que permite realizar análisis cualitativos y cuantitativos precisos.
La fase móvil transporta una muestra líquida a través de la columna hasta el detector, y los compuestos o analitos se separan debido a sus distintos grados de interacción con la fase estacionaria. Un detector mide los analitos después de su elución de la columna, y un sistema de datos cromatográficos traduce la señal detectada.
El resultado de un análisis HPLC es un cromatograma, cuyo eje x representa el tiempo y cuyo eje y mide una señal específica generada por el detector. En este contexto, el analito es el compuesto objetivo de interés, la fase móvil es la fase en movimiento formada por disolventes o eluyentes, y la fase estacionaria es la fase inmóvil donde tiene lugar la separación física de los analitos.
Por qué se purifican los cebadores mediante HPLC
La síntesis de oligonucleótidos se lleva a cabo sobre un soporte sólido, normalmente vidrio de poros controlado (CPG), en una serie de ciclos cuyo número corresponde a la longitud del oligonucleótido. Cada ciclo comprende una serie de reacciones químicas: 5′-desprotección, activación y acoplamiento, taponamiento y oxidación.
Una reacción química nunca se procesa completamente. Usando la química de fosforamidita, la reacción secundaria principal es la formación de productos n-x debido a la activación incompleta o al acoplamiento incompleto, respectivamente. Cuanto más larga sea la secuencia, más productos n-x se producirán.
La eficiencia de acoplamiento y la longitud del oligonucleótido determinan el rendimiento final del producto bruto mediante la relación Rendimiento = CEn-1. Por lo tanto, el rendimiento máximo teórico de un producto de longitud completa para un 50mer con una eficiencia de acoplamiento del 99,0% será del 61% y para un 150mer con una eficiencia de acoplamiento del 98,5% sólo será del 11%, respectivamente.
Los productos truncados pueden tener propiedades muy parecidas a las del cebador completo y, por ello, no siempre se eliminan mediante una simple desalinización. La purificación por HPLC de fase inversa aprovecha la diferencia de hidrofobicidad entre el oligonucleótido completo y los productos incompletos para mejorar la composición de la muestra.
Relación entre longitud, pureza y aplicación
En general, el nivel de pureza que se requiere depende del efecto que tendrán las secuencias alternativas, como los productos n-1, n-2 y n-x, en el experimento específico. Todos los oligos son al menos desalados para eliminar en gran medida los subproductos residuales de bajo peso molecular que surgen y se acumulan a partir de las frecuentes reacciones químicas durante la síntesis.
Dicha purificación es suficiente para oligonucleótidos menores que 30 y para oligonucleótidos usados en aplicaciones no críticas tales como PCR, secuenciación, sondado, desplazamiento de movilidad o hibridación. Sin embargo, los oligos desalados no se recomiendan para el uso en proyectos de clonación molecular.
| Método | Longitud o aplicación habitual | Características principales |
|---|---|---|
| Desalinización | Oligonucleótidos menores que 30 y aplicaciones no críticas | Elimina sales y subproductos residuales de bajo peso molecular |
| HPLC de fase inversa | Oligos menores de 50 bases | Elimina preferiblemente productos n-x truncados y proporciona una pureza del 90-95% |
| PAGE | Oligos largos, mayores de 50 bases | Presenta una resolución excelente y produce un producto que es, en promedio, 95-99% puro |
La RP-HPLC es útil cuando se requiere un nivel de pureza mayor para aplicaciones más exigentes tales como clonación, toma de huellas dactilares de ADN, PCR en tiempo real y FISH. La purificación por PAGE es generalmente necesaria para oligos largos, mayores de 50 bases, y para todos los cebadores con secuencias 5′ críticas, como sitios de endonucleasa de restricción y promotores de ARN.
PAGE es el mejor método para diferenciar oligos completos de secuencias abortadas, como los oligos n-1, basándose en el tamaño, la conformación y la carga. La purificación PAGE es altamente recomendada para experimentos sensibles tales como clonación, mutagénesis, toma de huellas de ADN, hibridación in situ y síntesis génica.
El nivel de pureza disminuye con el aumento de longitud del oligonucleótido, y esto es particularmente cierto para oligos mayores de 120 bases. En consecuencia, la elección entre desalinización, HPLC y PAGE debe relacionarse con la longitud de la secuencia, la proporción esperada de productos truncados y la sensibilidad de la aplicación.
Principio de la HPLC de fase inversa para cebadores
La HPLC de fase inversa utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil relativamente polar. En este modo, los oligonucleótidos y sus productos truncados interaccionan de manera diferente con la superficie hidrofóbica de la columna.
Los cebadores completos conservan el grupo de protección DMT hidrofóbico en el extremo 5’ durante la etapa de separación, mientras que muchos productos truncados n-x carecen de ese grupo. Esta diferencia modifica su retención y permite separar el producto de longitud completa de las secuencias abortadas.
La separación de una muestra depende de las propiedades fisicoquímicas del analito, como el tamaño, la carga, la polaridad y la volatilidad; de las propiedades de la fase estacionaria, como la polaridad, la carga y la viscosidad; y de las propiedades de la fase móvil y su interacción con el analito y la fase estacionaria.
La resolución es la capacidad de distinguir entre picos y constituye la preocupación principal de cualquier separación. La selectividad es la capacidad de separar dos analitos, mientras que el tiempo de retención es el intervalo entre la inyección de la muestra y la señal máxima del pico del analito en el cromatograma.
Componentes y etapas de un sistema HPLC
Un instrumento HPLC tiene cuatro componentes principales: una bomba para suministrar la fase móvil, un inyector automático para inyectar la muestra, una columna con fase estacionaria para separar los compuestos de la muestra y un detector para medir los compuestos.
Otros elementos incluyen capilares y tubos de conexión que permiten el flujo continuo de la fase móvil y de la muestra a través del sistema, además de un sistema de datos cromatográficos para controlar el instrumento HPLC, la separación, la detección y la evaluación de los resultados.
- La fase móvil comienza a fluir. La bomba impulsa los eluyentes o disolventes a través del sistema a un caudal específico.
- Se inyecta la muestra. Una vez introducida en el trayecto de flujo de la fase móvil, la muestra viaja desde el punto de inyección hasta la entrada de la columna.
- Se produce la separación de los compuestos. La separación física tiene lugar en la fase estacionaria de la columna.
- Los componentes separados de la muestra viajan hasta el detector después de eluir de la columna.
- Se detectan los analitos mediante una señal eléctrica generada por sus propiedades específicas.
- El sistema de datos cromatográficos traduce la señal detectada en un cromatograma de señal del analito frente al tiempo.
La eficiencia se expresa como el número de platos teóricos y constituye una métrica importante para cuantificar el rendimiento de una separación. El volumen muerto es todo el volumen de la columna que no está ocupado por la fase estacionaria.
Fase móvil, gradiente y detección
Todas las separaciones HPLC se realizan en uno de dos modos: isocrático o en gradiente. Los métodos isocráticos separan utilizando una composición constante del eluyente durante el análisis, como 100% de acetonitrilo o una mezcla 50:50 de acetonitrilo y agua.
Los métodos en gradiente incluyen un cambio en la composición de la fase móvil a lo largo de la separación. Estos métodos suelen emplear dos disolventes, denominados A y B, y comienzan con un porcentaje determinado de A respecto de B, seguido de un cambio porcentual durante la separación.
Las separaciones en gradiente suelen proporcionar un rendimiento superior a los modos isocráticos, aunque son más complejas y requieren un sistema de bombeo avanzado. En la purificación de cebadores, el gradiente debe permitir que el producto de longitud completa y las impurezas abandonen la columna en zonas suficientemente separadas.
La detección UV-Vis se utiliza habitualmente porque los oligonucleótidos absorben radiación ultravioleta. La espectrometría de masas puede incorporarse para determinar la masa molecular, confirmar la identidad del producto y distinguir especies estrechamente relacionadas.
Ejemplo de método HPLC para oligo(dT)12-18
El cebador Oligo(dT) 12-18 se utilizó para comprobar un método HPLC para el análisis de oligonucleótidos. La separación de estos cebadores Oligo(dT) 12-18 se llevó a cabo utilizando un método de HPLC de fase inversa de pares iónicos con una columna Interchim Uptisphere Strategy de 5 µm C18HQ de 250 x 4.6 mm.
Se inyectó una alícuota de 10 µl para todos los análisis y la temperatura de la columna se mantuvo a 30°C. La composición de la fase móvil A era TEAA 100 mM en agua, mientras que la fase móvil B era acetonitrilo, con un caudal de 1 ml/min.
| Parámetro | Condición |
|---|---|
| Columna | Interchim Uptisphere Strategy de 5 µm C18HQ de 250 x 4.6 mm |
| Volumen de inyección | 10 µl |
| Temperatura de la columna | 30°C |
| Fase móvil A | TEAA 100 mM en agua |
| Fase móvil B | Acetonitrilo |
| Caudal | 1 ml/min |
Después de la inyección de la muestra, la fase móvil B se ajustó al 10 % durante 1 minuto. Luego se aumentó linealmente al 15 % durante 24 minutos. A los 25.1 minutos, aumentó hasta el 95% y se mantuvo en este nivel durante 2.4 minutos para limpiar la columna.
Posteriormente, a los 27.6 minutos, se redujo al 10% y se mantuvo durante 2.4 minutos para equilibrar la columna. El método HPLC separa eficazmente los siete cebadores Oligo(dT) 12 a 18.
Separación de oligonucleótidos que difieren en un nucleótido
La mezcla de oligonucleótidos de ARN se preparó diluyéndola 10 veces con agua desionizada antes del análisis por HPLC. Las secuencias de cuatro estándares de ARN fueron las siguientes: 14 mer (CACUGAAUACCAAU), 17 mer (UCACACUGAAUACCAAU), 20 mer (UCAUCACACUGAAUACCAAU) y 21 mer (GUCUCAUCACACUGAAUACCAAU).
La separación de estas muestras de ARN se realizó utilizando un método de HPLC similar al de los cebadores oligo(dT)12-18, con ligeras modificaciones. Después de la inyección de la muestra, la fase móvil B se ajustó al 9% durante 1 minuto y luego se aumentó linealmente al 10% durante 24 minutos.
A los 25.1 minutos, la fase móvil B aumentó hasta el 95% y se mantuvo en este nivel durante 2.4 minutos para limpiar la columna. Posteriormente, a los 27.6 minutos, se redujo al 9% y se mantuvo durante 2.4 minutos para equilibrar la columna.
El método HPLC separa eficazmente las cuatro muestras de ARN, incluso con una diferencia de 1 mer entre las muestras de ARN de 20 y 21 mer. Esta separación de referencia para los 20 meros y 21 meros es crucial para analizar oligonucleótidos sintéticos, ya que la mayoría de las impurezas durante la síntesis suelen ser N=1 mer o N+1 mer.
Análisis de cebadores y muestras de ADN monocatenario
También se analizaron tres muestras de ADN monocatenario con 17 mer, 18 mer y 19 mer utilizando el método de HPLC modificado del utilizado para las muestras de ARN. La concentración de cada ssDNA fue de 30 μM y se cargaron alícuotas de 10 μL en la columna para su análisis.
El análisis de HPLC se realizó utilizando el siguiente gradiente: después de la inyección de la muestra, la fase móvil B se ajustó al 9% durante 1 minuto y luego se aumentó linealmente al 15% durante 24 minutos. A los 25.1 minutos, aumentó hasta el 95% y se mantuvo en este nivel durante 2.4 minutos para limpiar la columna.
A los 27.6 minutos, la fase móvil B se redujo al 9% y este nivel se mantuvo durante 2.4 minutos para equilibrar la columna. El caudal para el análisis se ajustó a 1.5 ml/min.
A pesar del mayor cambio en el disolvente B por minuto en comparación con las muestras de ARN, el método separa eficazmente las tres muestras de ssDNA con una buena resolución inicial.
| Muestra | Longitud | Secuencia |
|---|---|---|
| ssDNA-1 | 17 mer | GTC AGC AAG GAC ATC GT |
| ssDNA-2 | 18 mer | CAT TTG AGT AGC CAA CGC |
| ssDNA-3 | 19 mer | GGA CAC TTT CAT GCG AGT T |
Evaluación de la pureza por HPLC-UV
El mismo método utilizado para las muestras de ssDNA también se empleó para el análisis de pureza de una muestra de ssDNA de 19 mer: 5'-TGGCGGGCGTACCTGGACT-3'. La muestra presentó una pureza UV del 74.3% a 260 nm, determinada utilizando el software Advion Data Express.
La medición UV permite estimar la proporción de material que absorbe a la longitud de onda seleccionada, pero la interpretación debe relacionarse con la separación cromatográfica y con el objetivo del análisis. La presencia de picos separados permite valorar el producto principal y las especies secundarias según sus áreas y tiempos de retención.
Confirmación de masa mediante HPLC-MS
El análisis HPLC/MS de oligonucleótidos se realizó utilizando un sistema HPLC Advion AVANT® acoplado con un Advion Exprensaion® CMS-L. Para el análisis de MS se utilizó una columna Interchim Uptisphere Strategy 2.6 μm C18-HQ con dimensiones 50 x 2.1 mm, con un caudal de 0.2 ml/min.
La temperatura de la columna se ajustó a 55°C. En comparación con el uso de TEAA para el análisis de masas de oligonucleótidos, los reactivos de pares iónicos que combinan TEA y HFIP ofrecen un rendimiento significativamente mejorado.
La fase móvil consistió en TEA 15 mM y HFIP 10 mM en agua como fase móvil A y metanol como fase móvil B. El tiempo total de ejecución de HPLC fue de 25 minutos, comenzando con 5% de disolvente B durante 1 minuto.
Luego se aumentó el porcentaje de B al 6% durante 14 minutos, seguido de un aumento al 95% a los 15.1 minutos que se mantuvo durante 2.9 minutos para eluir los compuestos de interés. Posteriormente, el porcentaje de B se redujo al 5% y se mantuvo en este nivel durante 6.9 minutos para equilibrar la columna antes del siguiente análisis.
| Parámetro | Condición |
|---|---|
| Sistema | Advion AVANT® HPLC acoplado con Advion Exprensaion® CMS-L |
| Columna | Interchim Uptisphere Strategy 2.6 μm C18-HQ, 50 x 2.1 mm |
| Caudal | 0.2 ml/min |
| Temperatura | 55°C |
| Fase móvil A | TEA 15 mM y HFIP 10 mM en agua |
| Fase móvil B | Metanol |
| Ionización | ESI negativo |
| Rango de exploración | 500-2000 Da |
El análisis de MS se realizó en modo ESI negativo con el rango de exploración de MS establecido entre 500 y 2000 Da. Para la muestra ssDNA-4 se observó una envoltura cargada con picos en m/z 1463.9 (4-), 1170.8 (5-), 975.8 (6-), 936.0 (7-), 731.8 (8-) y 650.2 (9-).
Mediante la deconvolución de carga en Data Express, se determinó que la masa sin carga para la muestra de ssDNA era 5861.8 Da, que coincide estrechamente con el valor teórico de 5860.8 Da.
Los espectros de MS de ssDNA-5 mostraron una envoltura cargada con picos en m/z 1477.8 (4-), 1182.1 (5-), 984.7 (6-), 843.8 (7-) y 738.2 (8-). Mediante deconvolución de carga, se determinó que la masa sin carga del ssDNA-5 era 5913.9, lo que concuerda estrechamente con el valor teórico de 5914.9.
Para el análisis por HPLC de oligonucleótidos, una columna C5HQ con un tamaño de partícula de 18 μm acoplada con un reactivo de emparejamiento iónico TEAA es una solución adecuada. Para el análisis MS de oligonucleótidos, se puede emplear una columna C18HQ con HFIP y TEA como reactivo de emparejamiento iónico junto con un sistema HPLC-UV/CMS.
Este método produce mediciones de masa precisas adicionales de oligonucleótidos. En general, utilizar la columna Interchim C18HQ y el reactivo de emparejamiento iónico adecuado en combinación con sistemas HPLC-UV y -CMS puede proporcionar una solución confiable para el análisis de pureza y la caracterización de oligonucleótidos.
Preparación de la muestra antes de la HPLC
La fiabilidad de los datos cromatográficos depende en gran medida de un paso crucial: la preparación de la muestra con HPLC. Antes de la inyección, es necesario aislar los analitos, eliminar las sustancias que interfieren y concentrar los compuestos objetivo.
Los oligonucleótidos se disuelven generalmente mejor en agua estéril o tampón Tris-HCl 10 mM con pH 7,5. Los oligos que llevan un colorante fluorescente no deben disolverse en agua destilada, porque el agua destilada por lo general tiene un pH de aproximadamente 6,0 que favorece la degradación del colorante fluorescente.
Los oligos que llevan colorantes fluorescentes de la familia de las cianinas como Cy3 no deben disolverse en tampón Tris-HCl 10 mM a pH 7,5, ya que se degradan lentamente a pH superior a 7,5. En tales casos, se utiliza únicamente agua destilada.
Resuspensión de un cebador liofilizado
- Hacer un spin corto a la máxima velocidad en una centrífuga para recoger el gránulo en la parte inferior del tubo.
- Añadir una cantidad apropiada de agua estéril o tampón.
- Calentar el tubo durante 5 minutos a 65°C.
- Hacer vortex o mezclar pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo.
Los oligonucleótidos son generalmente más estables a mayores concentraciones. Durante su manipulación se deben utilizar únicamente soluciones sin nucleasas y se debe trabajar con cuidado para evitar la contaminación bacteriana.
Algunos colorantes fluorescentes, especialmente los colorantes Cy, son particularmente sensibles a la luz, y la exposición a la luz debe minimizarse. Además, algunos colorantes pueden ser sensibles a la oxidación, por lo que sólo se debe abrir el tubo cuando sea necesario.
Almacenamiento de los cebadores purificados
Se deben evitar las descongelaciones y congelaciones repetidas, ya que las fuerzas físicas implicadas pueden degradar los oligos. Dependiendo del experimento, se debe elegir una condición de almacenamiento adecuada.
La preparación de alícuotas puede tener sentido si los oligos deben almacenarse y utilizarse durante un largo período de tiempo sin perder actividad. Las alícuotas reducen el número de ciclos de congelación y descongelación y limitan la exposición repetida a la luz, al aire y a posibles contaminantes.
Control de calidad de los cebadores
Un sistema riguroso de control de calidad garantiza una alta calidad consistente de los oligonucleótidos. La monitorización trityl en línea permite controlar la eficiencia del acoplamiento después de cada ciclo de síntesis.
Después de la síntesis, la identidad molecular de los oligonucleótidos puede verificarse mediante MALDI-TOF para secuencias de hasta 50 bases o mediante PAGE analítica para secuencias de 51 a 150 bases.
La HPLC-UV permite evaluar el perfil de pureza y la proporción relativa de las especies separadas. La HPLC-MS añade la confirmación de la masa molecular, lo que ayuda a verificar que el pico principal corresponde al cebador esperado.
Escala analítica y escala preparativa
La HPLC analítica se utiliza para identificar y cuantificar componentes de una mezcla, desarrollar métodos y evaluar la pureza. La HPLC preparativa implica recoger eluyente fraccionado en recipientes de muestra separados para aislar uno o más analitos con el fin de purificar componentes principales o aislar impurezas para investigaciones posteriores.
Las separaciones preparativas se dividen en escalas analítica, semipreparativa y preparativa. El objetivo de la separación determina la escala, el tamaño de la columna y el caudal.
| Escala | Dimensiones o caudal indicados | Uso principal |
|---|---|---|
| Analítica | Columnas inferiores a 4.6 mm y caudales inferiores a 2 mL/min | Desarrollo de métodos, control de pureza y caracterización |
| Semipreparativa | Columnas de 10-30 mm y caudales de 5-50 mL/min | Purificación a pequeña escala y aislamiento para análisis estructural |
| Preparativa | Columnas de 50-200 mm y caudales superiores a 50 mL/min | Purificación a gran escala y procesos de fabricación |
La búsqueda de condiciones de separación puede realizarse primero a escala analítica y trasladarse posteriormente a escala preparativa. Este procedimiento permite estudiar la retención, la resolución y el comportamiento del gradiente antes de aumentar la cantidad de muestra.
Los sistemas preparativos pueden configurarse para trabajar con detección UV, detección de masas o ambas. La recolección de fracciones puede activarse mediante detección UV, detección de masas o las dos señales, aumentando la selectividad y reduciendo la recolección innecesaria de fracciones.
HPLC dirigida por masas para cebadores
La incorporación de la espectrometría de masas a los flujos de trabajo de purificación permite activar la recolección de fracciones en función de valores específicos de masa a carga, m/z. Esto permite aislar selectivamente compuestos de interés con mayor precisión que mediante la detección UV sola.
La detección UV puede recoger impurezas que absorben en la misma región espectral que el cebador, mientras que la detección de masas permite discriminar las fracciones según la masa objetivo. Como resultado, la purificación dirigida por masas aumenta la pureza de las fracciones recolectadas, reduce los falsos positivos y minimiza la necesidad de reprocesamiento.
La HPLC-MS es especialmente valiosa en flujos de trabajo que involucran mezclas complejas, compuestos estrechamente relacionados o analitos con señales UV débiles o superpuestas. El resultado es un proceso de purificación más rápido y confiable con mayor eficiencia general y recuperación de compuestos.
Factores que afectan a la separación HPLC
Muchos factores influyen en las separaciones HPLC, incluida la composición de la fase móvil, la química de la fase estacionaria y la temperatura. Una separación satisfactoria sólo ocurre si los analitos presentan afinidades diferentes por la fase estacionaria, por lo que la selección de la fase estacionaria adecuada es crucial.
- Propiedades fisicoquímicas del analito, como tamaño, carga, polaridad y volatilidad.
- Propiedades fisicoquímicas de la fase estacionaria, como polaridad, carga y viscosidad.
- Propiedades fisicoquímicas de la fase móvil y su interacción con el analito y la fase estacionaria.
- Modo de separación isocrático o en gradiente.
- Caudal de la fase móvil.
- Temperatura de la columna.
- Tamaño de partícula y dimensiones de la columna.
- Volumen de inyección y concentración de la muestra.
La HPLC estándar utiliza partículas de fase estacionaria de 3-5 µm y funciona a presiones de hasta 600 bar, con caudales de 1-2 mL/min. La UHPLC se basa en partículas de menos de 2 µm y funciona a presiones de 600-1200 bar, con caudales de 0.2-0.7 mL/min.
El intervalo de presión más elevado de la UHPLC proporciona mejor resolución y sensibilidad, mayor productividad y menor consumo de disolvente que los sistemas HPLC estándar. La UHPLC permite utilizar columnas de menor diámetro interno y partículas más pequeñas para realizar análisis más rápidos.
Selección entre HPLC, PAGE y otras estrategias
La desalinización elimina sales y subproductos residuales de bajo peso molecular, pero no separa necesariamente los fragmentos más cortos que el cebador objetivo. La purificación por PAGE ofrece una resolución excelente para separar oligos completos de secuencias abortadas basándose en tamaño, conformación y carga.
La HPLC de fase inversa ofrece una solución eficaz para cebadores de longitud inferior a 50 bases cuando se necesita una pureza superior a la obtenida mediante desalinización. La elección de PAGE puede ser más apropiada para oligos largos o para secuencias con regiones 5′ críticas.
La cromatografía líquida puede clasificarse según el mecanismo de separación entre el analito, la fase estacionaria y la fase móvil. Los tipos más comunes son la cromatografía de fase inversa, la cromatografía de fase normal, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de exclusión por tamaño.
Otros métodos especializados son la cromatografía de afinidad y la cromatografía de interacción hidrofílica, que se centran en interacciones moleculares específicas o compuestos polares. Para la purificación de cebadores, la fase inversa es especialmente relevante porque permite aprovechar las diferencias de hidrofobicidad asociadas al grupo DMT y a los productos truncados.
Optimización y trazabilidad del proceso
La optimización de los métodos y sistemas cromatográficos preparativos debe resolver los problemas que presenta la separación y purificación de compuestos con un amplio abanico de estructuras y variadas propiedades fisicoquímicas, como solubilidad y pKa.
También debe maximizar el intervalo de cantidades de producto a purificar por inyección, permitir variar fácilmente las condiciones de trabajo para generar condiciones ortogonales y establecer un procedimiento de búsqueda de condiciones de separación a escala analítica y de su traslado a escala preparativa.
Los protocolos de control de calidad interno deben garantizar el correcto funcionamiento, la reproducibilidad y la trazabilidad de los procesos. Un protocolo de trabajo completo para un laboratorio de HPLC-MS debe integrar la preparación de muestras, la selección de columna, el desarrollo del gradiente, la adquisición de datos, la evaluación de pureza y la confirmación de identidad.
Los sistemas de purificación pueden combinar cromatografía líquida de alto rendimiento, recolección automatizada de fracciones y detección de masas opcional. Las configuraciones pueden adaptarse a la purificación en fase reversa, fase normal y fase quiral, aunque para cebadores y oligonucleótidos la fase reversa es la estrategia central.
Las plataformas modulares también permiten añadir módulos de purificación a sistemas LC existentes. La compatibilidad con detectores UV, MS y ELSD facilita que el laboratorio adapte su estrategia de purificación a medida que aumentan sus necesidades.
La cromatografía de fluidos supercríticos puede incorporarse como técnica complementaria dentro de una plataforma de purificación, especialmente cuando se buscan separaciones rápidas, eficientes y con menor consumo de disolventes. La HPLC preparativa mantiene su utilidad por su fiabilidad comprobada y su aplicación ampliamente establecida.
Errores frecuentes durante la purificación
Una selección inadecuada de la columna puede producir baja resolución, tiempos de retención poco útiles o pérdida de recuperación. La composición de la fase móvil debe ser compatible con la hidrofobicidad del cebador, la estabilidad de la secuencia, la detección seleccionada y el objetivo de la separación.
Un volumen de inyección excesivo puede ensanchar los picos y reducir la resolución entre el cebador completo y los productos n-x. Una concentración demasiado baja puede dificultar la detección UV y reducir la cantidad recuperada en las fracciones.
La falta de equilibrado de la columna puede modificar los tiempos de retención entre inyecciones. Después de una etapa de limpieza con un porcentaje elevado de disolvente orgánico, la columna debe volver a las condiciones iniciales durante un tiempo suficiente antes de la siguiente muestra.
La contaminación por nucleasas, la exposición innecesaria a la luz, la disolución en un tampón inadecuado y los ciclos repetidos de congelación y descongelación pueden comprometer la estabilidad del cebador antes incluso de la inyección.
Aplicaciones de los cebadores purificados
Los cebadores purificados mediante HPLC pueden emplearse en clonación, toma de huellas dactilares de ADN, PCR en tiempo real, FISH y otras aplicaciones en las que las secuencias truncadas o las impurezas pueden afectar a la especificidad o a la reproducibilidad.
Los oligonucleótidos han ganado una atención significativa en el desarrollo biofarmacéutico debido a su capacidad para modular la expresión de genes o proteínas. Estos medicamentos incluyen oligonucleótidos antisentido, terapias de ARN pequeño de interferencia y vacunas basadas en ARNm.
La síntesis en fase sólida es un método comúnmente utilizado para producir secuencias de oligonucleótidos. La materia prima normalmente se purifica mediante diversas técnicas, como desalinización, ultrafiltración, extracción en fase sólida, HPLC o cromatografía líquida preparativa, según el nivel de pureza deseado.
A menudo se prefieren los métodos HPLC de emparejamiento iónico o prepLC, ya que ofrecen una mayor pureza en comparación con otras técnicas. La combinación de análisis HPLC-UV y HPLC-MS permite comprobar simultáneamente la separación, la pureza cromatográfica y la correspondencia entre la masa observada y la masa teórica.
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