Los plásmidos son herramientas de investigación comunes utilizadas en muchas aplicaciones, como la clonación, la transfección, las reacciones de transcripción y traducción sin células y la secuenciación del ADN.
El ADN plasmídico es un anillo de ADN que no se encuentra situado en un cromosoma, pero que es capaz de replicarse de forma autónoma. Generalmente se utiliza para purificar una secuencia concreta, dado que puede separarse con facilidad del resto del genoma.
Estas características hacen que la purificación del ADN plasmídico sea una etapa fundamental cuando se necesita obtener una secuencia definida con suficiente pureza para aplicaciones de biología molecular.
Principio de la purificación del ADN plasmídico
La mayoría de los sistemas de purificación de plásmidos lisan las células bacterianas mediante un método de lisis alcalina modificado, seguido de una rápida neutralización para volver a aparear los plásmidos, pero no el ADN genómico.
La separación se basa en las diferencias físicas y estructurales entre el ADN plasmídico y el ADN cromosómico. El plásmido, al ser una molécula circular capaz de replicarse de forma autónoma, puede recuperarse con mayor facilidad tras la lisis celular y la neutralización.
El método de aislamiento a pequeña escala basado en lisis alcalina permitió la extracción de ADN plasmídico de elevado peso molecular a partir de bacterias extraídas de zonas acuícolas.
| Elemento | Característica |
|---|---|
| ADN plasmídico | Anillo de ADN no situado en un cromosoma y capaz de replicarse de forma autónoma |
| Proceso celular inicial | Lisis bacteriana mediante un método de lisis alcalina modificado |
| Etapa posterior | Rápida neutralización para reanear los plásmidos, pero no el ADN genómico |
| Purificación | Unión del plásmido a una columna |
| Lavado | Solución que contiene alcohol para eliminar contaminantes |
| Elución | Recuperación del ADN plasmídico con un tampón apropiado |
Etapas generales del procedimiento
Lisis de las células bacterianas
El procedimiento comienza con la lisis de las células bacterianas mediante una versión modificada de la lisis alcalina.
Durante esta etapa se rompe la estructura celular para liberar el contenido intracelular, incluido el ADN plasmídico. La lisis alcalina constituye la base de numerosos sistemas de purificación porque permite procesar el material bacteriano antes de la separación del plásmido y de los contaminantes celulares.
Neutralización rápida
Después de la lisis se realiza una rápida neutralización.
Esta neutralización permite que los plásmidos vuelvan a aparearse, pero no el ADN genómico. De esta manera se favorece la separación del ADN plasmídico respecto del material cromosómico y de otros componentes celulares liberados durante la lisis.
Unión a la columna
Una vez realizada la neutralización, el plásmido se purifica mediante su unión a una columna.
La columna permite retener el ADN plasmídico y facilitar su separación del resto de los componentes presentes en la preparación. Los sistemas basados en columnas ofrecen un procedimiento rápido para obtener ADN plasmídico purificado.
Lavado de la columna
Las columnas suelen lavarse con una solución que contiene alcohol para eliminar los contaminantes.
La etapa de lavado contribuye a retirar sustancias que podrían interferir en aplicaciones posteriores, sin eliminar el ADN plasmídico retenido en la columna.
Elución del ADN plasmídico
Finalmente, el ADN plasmídico se eluye con un tampón apropiado.
La elución permite recuperar el plásmido purificado en una solución adecuada para su utilización posterior en clonación, transfección, reacciones de transcripción y traducción sin células o secuenciación del ADN.
Aislamiento de DNA plasmídico recombinante de Escherichia coli. Método de lisis alcalina.
Obtención de ADN plasmídico de elevado peso molecular
El método de aislamiento a pequeña escala basado en lisis alcalina permitió la extracción de ADN plasmídico de elevado peso molecular.
La obtención de ADN plasmídico de elevado peso molecular es importante cuando la preparación debe conservar una molécula plasmídica suficientemente completa para las aplicaciones posteriores.
Generalmente se utiliza para purificar una secuencia concreta, dado que puede separarse con facilidad del resto del genoma.
Gracias a estas características, el método constituye un medio eficaz y rentable para hallar ADN plasmídico.
Importancia de la eliminación de endotoxinas
La endotoxina, también denominada lipopolisacárido o LPS, es un componente de la pared celular de todas las bacterias gramnegativas.
La endotoxina es un potente estimulador del sistema inmunitario de los mamíferos in vivo.
Además, puede disminuir la viabilidad de las células de cultivo tisular e inhibir la eficiencia de la transfección in vitro.
Por esta razón, la eliminación de contaminantes durante el lavado de la columna es especialmente relevante cuando el ADN plasmídico se destina a trabajos con células de mamífero o a procedimientos de transfección.
Aplicaciones del ADN plasmídico purificado
- Clonación.
- Transfección.
- Reacciones de transcripción y traducción sin células.
- Secuenciación del ADN.
- Purificación de una secuencia concreta.
Los plásmidos se emplean como herramientas de investigación en numerosas aplicaciones, por lo que la calidad de la preparación obtenida debe corresponder al uso posterior.
La combinación de lisis alcalina, neutralización rápida, unión a una columna, lavado con una solución que contiene alcohol y elución con un tampón apropiado permite disponer de un sistema de purificación rápido y funcional.
Aplicación en bacterias procedentes de zonas acuícolas
Los agentes antimicrobianos son fármacos naturales o sintéticos que inhiben o matan bacterias, lo que los convierte en sustancias excepcionales para controlar enfermedades infecciosas letales.
Esto es especialmente visible en el sureste asiático, donde la industria acuícola representa un importante segmento de la producción de animales para consumo alimentario.
En la actualidad es limitada la información disponible sobre el tipo y la cantidad de agentes antimicrobianos utilizados en las piscifactorías, lo cual dificulta en gran medida la evaluación de los posibles riesgos para la salud que plantea el empleo de agentes antimicrobianos.
Por todo ello, el proyecto ASIARESIST examinó la probabilidad de que surjan genes transferibles de resistencia antimicrobiana en el marco de la industria acuícola del sureste asiático.
Gracias a estos trabajos se mejoró un método para la minipreparación de ADN plasmídico a partir de bacterias extraídas de zonas acuícolas.
El método permitió obtener ADN plasmídico mediante un aislamiento a pequeña escala y proporcionó un medio eficaz y rentable para hallar moléculas plasmídicas en muestras bacterianas relacionadas con la acuicultura.
Relación entre los plásmidos y la resistencia antimicrobiana
El carácter autónomamente replicativo de los plásmidos les permite actuar como elementos de interés en el estudio de genes transferibles.
La purificación de ADN plasmídico a partir de bacterias procedentes de zonas acuícolas facilita el análisis de estas moléculas y contribuye a examinar la probabilidad de que surjan genes transferibles de resistencia antimicrobiana en el marco de la industria acuícola del sureste asiático.
La utilidad del método se relaciona tanto con la recuperación de ADN plasmídico de elevado peso molecular como con la posibilidad de separar una secuencia concreta del resto del genoma.
Aspectos que deben considerarse en la preparación
- El método debe incluir una lisis bacteriana eficaz.
- La neutralización debe realizarse rápidamente para favorecer el reapareamiento de los plásmidos, pero no del ADN genómico.
- La columna debe permitir la retención del ADN plasmídico.
- El lavado debe eliminar contaminantes mediante una solución que contenga alcohol.
- La elución debe realizarse con un tampón apropiado.
- La presencia de endotoxina debe considerarse cuando el ADN se utilice en cultivos celulares o transfección.
- La calidad del ADN plasmídico debe ser compatible con la aplicación posterior.
La purificación del ADN plasmídico combina una separación basada en la lisis alcalina con una fase de unión, lavado y elución en columna. Gracias a esta organización, el ADN plasmídico puede recuperarse de forma eficaz y utilizarse en aplicaciones de investigación molecular.
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