La separación de células mediante microfiltros es un proceso físico que utiliza membranas con poros microscópicos para retener selectivamente células y partículas según su tamaño, deformabilidad y comportamiento hidrodinámico. Esta estrategia permite separar células tumorales circulantes, glóbulos blancos y glóbulos rojos de una muestra sanguínea sin utilizar productos químicos.
El diseño de microfiltros para la captura de células cancerígenas se apoya en los microsistemas o sistemas microelectromecánicos (MEMS), la mecánica de fluidos y la mecánica de fluidos computacional (CFD). En un diseño final basado en bifurcaciones y canales laterales, se evaluaron células cancerígenas con diámetros entre D=14-20μm y viscosidades entre μ=20-200Pa∙s, alcanzándose una eficiencia de separación superior a e>90% y una pureza de 99.99%.
Principio de la separación celular mediante microfiltros
La microfiltración es un proceso de separación física utilizado en una amplia gama de industrias para filtrar líquidos al retener partículas de mayor tamaño que los poros de una membrana microfiltrante. Esta técnica se basa en el principio de filtración mediante una membrana porosa, cuyos poros tienen un tamaño de 1-20 µm.
Cuando el agua pasa a través de la membrana microfiltrante, las partículas sólidas, microorganismos y otras impurezas son retenidas por esta. Este tipo de sistema de filtrado tiene un alto grado de retención de sustancias gracias al reducido tamaño de los poros.
La microfiltración permite separar partículas sin utilizar productos químicos, lo que la convierte en una opción respetuosa con el medio ambiente y muy adecuada para aplicaciones sensibles, como la industria alimentaria y farmacéutica. Además, la microfiltración es versátil y adaptable a diversas necesidades industriales.
Fundamentos físicos de la separación celular
La eficacia de un microfiltro celular depende de la relación entre el tamaño de los poros, el diámetro de las células, la viscosidad celular, la deformabilidad de la membrana y las condiciones de flujo. Para la caracterización de células cancerígenas, glóbulos blancos y rojos se definen las propiedades mecánicas de la membrana celular y la viscosidad de cada tipo según la literatura.
Luego sometemos cada célula a una deformación midiendo la presión crítica, comparada y validada con modelos de micropipetas y simulaciones de celdas a través de microfiltros. La presión crítica permite estudiar la capacidad de una célula para atravesar una abertura, desviarse hacia un canal o quedar retenida en una región del dispositivo.
La microfiltración retiene partículas de mayor tamaño que los poros de una membrana microfiltrante, aunque la separación de células no depende únicamente de una comparación rígida entre diámetro celular y tamaño de poro. La capacidad de deformación de la célula y su interacción con la corriente también influyen en la trayectoria final.
Diseño de un microfiltro para células tumorales circulantes
El objetivo de la propuesta es el diseño de un dispositivo para separar células cancerosas del fluido sanguíneo, con una eficiencia superior al 70%. Con los modelos de células establecidos, se diseña el dispositivo de filtración mediante una variación del caudal y geometría.
Se selecciona la mejor condición hidrodinámica que genere el comportamiento favorable de la clasificación celular. La primera etapa realiza un filtrado de CTCs, y en la segunda etapa se filtran las células WBCs-RBCs.
Para las simulaciones se genera la malla en dos dimensiones utilizando elementos cuadrilaterales y el método VOF de fracción de volumen utilizando FLUENT ANSYS. La simulación permite analizar el movimiento de las células, el reparto del caudal y la influencia de la geometría sobre la separación.
Separación en dos etapas
- Primera etapa: captura o desviación de las células tumorales circulantes.
- Segunda etapa: separación de las células sanguíneas restantes, principalmente glóbulos blancos y glóbulos rojos.
En el diseño final del microfiltro, en la bifurcación, las células cancerígenas evaluadas con diámetros entre D=14-20μm y viscosidades establecidas entre μ=20-200Pa∙s se logra una separación del fluido principal con eficiencia mayor a e>90%.
Los vórtices generados en los canales laterales mantienen la pureza de la muestra evitando el desplazamiento lateral de las RBC y WBC y siguiendo la corriente principal generando pureza de 99.99%.
Parámetros que determinan el rendimiento
| Parámetro | Función en la separación |
|---|---|
| Tamaño de los poros | Determina qué partículas y células pueden ser retenidas o atravesar la membrana. |
| Diámetro celular | Permite diferenciar células con tamaños distintos. |
| Viscosidad celular | Influye en la deformación y en la capacidad de atravesar una abertura. |
| Propiedades mecánicas de la membrana | Determinan la respuesta de la célula ante la presión y el flujo. |
| Caudal | Modifica las fuerzas hidrodinámicas y la trayectoria celular. |
| Geometría del dispositivo | Controla las bifurcaciones, los canales laterales y la formación de vórtices. |
La capacidad y la eliminación microbiana deberán estar balanceados para garantizar un proceso seguro y eficiente. En la separación celular mediante microfiltros, este equilibrio se relaciona con la eficiencia de captura, la pureza de la fracción obtenida, el caudal y la viabilidad de las células.
Microfiltración y tamaños de poro
En el ámbito de la microfiltración hablamos de micrómetros para describir el tamaño de los poros de las membranas filtrantes. Los micrómetros son una unidad de medida que equivale a una millonésima parte de un metro.
| Técnica | Rango de poros | Partículas o moléculas retenidas |
|---|---|---|
| Microfiltración | 1-20 µm | Partículas sólidas, microorganismos y otras impurezas de mayor tamaño que los poros. |
| Ultrafiltración | 0.01 a 0.1 μm | Moléculas más grandes como proteínas y virus. |
| Nanofiltración | 0.001 a 0.01 μm | Moléculas más pequeñas, como sales y materia orgánica. |
| Ósmosis inversa | 0.0001 a 0.001 μm | Sales disueltas y compuestos orgánicos. |
La microfiltración, junto con otras técnicas de filtración como la ultrafiltración, nanofiltración y ósmosis inversa, se utilizan para filtrar aguas al retener partículas de diferentes tamaños.
Si hablamos de filtros de anillas y filtros de mallas, también utilizaremos como unidad de medida la micra, aunque lo correcto es hablar de estas medidas en luz de paso. En el caso de los filtros de arena, lo que se tendrá en cuenta es el tipo de lecho filtrante.
Comparación con otras técnicas de separación celular
El aislamiento de una población celular específica a partir de una muestra heterogénea se ha convertido en un procedimiento común en los laboratorios. Hasta el momento, las técnicas que se han utilizado para este fin son:
- Métodos basados en centrifugación.
- Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
- Separación celular magnética.
La separación mediante microfiltros se diferencia de FACS y de la separación magnética porque se basa principalmente en propiedades físicas, como el tamaño, la deformabilidad y la respuesta hidrodinámica, mientras que FACS y los métodos magnéticos utilizan anticuerpos para seleccionar poblaciones celulares.
Citometría de flujo y FACS
La separación celular por citometría de flujo es una técnica de separación física de partículas en base a la expresión diferencial de uno o varios parámetros analizables por técnicas de citometría de flujo analítica. Las células individuales son interrogadas por el láser como en un citómetro analizador.
El citómetro separado hace que se formen gotas de un tamaño prácticamente constante y en función de la fluorescencia que presenta se le asigna un tipo de carga. Al pasar entre dos placas cargadas que establecen un campo eléctrico entre ellas se desviarán hacia la placa que tenga polaridad opuesta, de modo que cada tipo de gota se recoge en un tubo distinto.
La técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia, conocida como FACS o Fluorescence-Activated Cell Sorting en inglés, representa un enfoque especializado dentro del ámbito de la citometría de flujo. Su principal función es permitir la separación y selección de células de manera individualizada en dos o más tubos, a partir de una compleja mezcla de diferentes poblaciones celulares.
Esta separación se logra teniendo en cuenta las características específicas de cada célula, tales como su dispersión de luz y niveles de fluorescencia. El proceso comienza con la suspensión de células, que es dirigida hacia el centro de una corriente de líquido estrecha y de rápido flujo.
La clave para su funcionamiento radica en un mecanismo de vibración ultrasónica que fragmenta la corriente de líquido que contiene las células en pequeñas gotas. Un cuidadoso ajuste del sistema asegura que haya una baja probabilidad de que más de una célula quede contenida en cada gota.
Justo antes de que estas gotas se formen, el flujo atraviesa una cámara especial donde las células son excitadas por láseres y se mide la fluorescencia característica de cada una. Posteriormente, estas gotas cargadas son dirigidas a través de un sistema de deflexión electrostática que las redirige a diferentes tubos de recolección, dependiendo de su carga eléctrica respectiva.
Separación celular magnética
La separación celular magnética es una técnica innovadora que ha revolucionado la purificación de células en la investigación y aplicaciones clínicas. Basada en partículas magnéticas, permite aislar selectivamente células de interés, ofreciendo precisión y eficiencia.
En la técnica de separación celular magnética, los anticuerpos específicos se conjugan con partículas magnéticas y se unirán a las células que expresan el antígeno diana. Gracias a la aplicación de un campo magnético, las células serán atraídas hacia el imán, separándolas del resto de las poblaciones celulares.
Hay dos tipos de selección. La separación de las células puede ocurrir a través de selección positiva o selección negativa. Esto depende de si los anticuerpos ligados a las nanopartículas magnéticas se dirigen directamente a las células de interés o a las células no deseadas.
Ventajas y limitaciones comparativas
| Método | Base de separación | Característica principal |
|---|---|---|
| Microfiltración | Tamaño, deformabilidad y flujo | No requiere marcaje químico y puede integrarse en dispositivos microfluídicos. |
| FACS | Dispersión de luz y fluorescencia | Permite separar células individualizadas en dos o más tubos. |
| Separación magnética | Anticuerpos y campo magnético | Permite aislar selectivamente células que expresan un antígeno diana. |
| Centrifugación | Densidad y sedimentación | Se utiliza como método físico de separación de poblaciones celulares. |
En la actualidad existen diferentes tecnologías de separación y purificación celular, de las cuales las más utilizadas son las basadas en métodos de identificación y caracterización de las poblaciones celulares mediante anticuerpos monoclonales que reconocen marcadores específicos para, posteriormente, separar las poblaciones celulares mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo o métodos magnéticos.
Aplicaciones de los microfiltros celulares
La microfiltración se puede llevar a distintos contextos. Desde el tratamiento del agua para su posterior uso en procesos como la ósmosis inversa o la esterilización ultravioleta, hasta la separación de emulsiones de agua y aceite.
Además, en la industria alimentaria y farmacéutica, así como su aplicación en la clarificación de zumos de frutas, vinos y cerveza, desempeña un papel crucial. En proyectos de filtración relacionados con el tratamiento de aguas residuales, la microfiltración se convierte en una herramienta indispensable.
En el ámbito biomédico, los microfiltros pueden emplearse para enriquecer células tumorales circulantes, separar subpoblaciones sanguíneas y preparar muestras para análisis posteriores. La realización de ensayos en poblaciones celulares puras, como células stem normales y tumorales, tiene cada día más importancia tanto en investigación como en el diagnóstico clínico empleando métodos de genómica o proteómica.
Preparación de medios de cultivo celular
Los medios de cultivo celular son mezclas complejas de componentes sintéticos y biológicos que ofrecen la composición adecuada de nutrientes para una adecuada propagación celular y una alta expresión proteínica. Las características clave son garantizar la seguridad y la pureza del producto.
Por lo general, los medios de cultivo celular son mezclados a granel y transferidos asépticamente al biorreactor. Los medios de cultivo celular deben ser preparados cuidadosamente para asegurar la esterilidad del lote de cultivos celulares.
Existen diferentes tipos y formulaciones de cultivo celular que cubren las necesidades de diferentes líneas celulares. Como resultado, hoy en día existe una gran variedad de componentes de medios a una amplia gama de concentraciones.
La disolución de medios de cultivo celular se puede facilitar mediante sistemas de mezcla de uso único o desechables. Sistemas desechables de mezcladores y filtración ofrecen ventajas operativas al eliminar pasos de los procesos limpieza in situ (CIP) y esterilización por vapor in situ (SIP), lo que da como resultado un menor uso de agua y un menor consumo de WFI.
Microfiltración y contaminación por Mycoplasma
La contaminación por Mycoplasma representa un gran problema para los fabricantes biofarmacéuticos, ya que esta pequeña y astuta bacteria prolifera en un ambiente rico en nutrientes del biorreactor, además de que puede pasar a través de un filtro de grado esterilizante de 0.2 µm e inducir cambios en el metabolismo y en los niveles de expresión celulares.
El Mycoplasma puede contaminar a un proceso de cultivo celular a través de materias primas vegetales y animales, así como de humanos. Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini y M. hyorhinis son aislados de hidrolizados, líneas celulares y plasma.
M. fermentans, M. orale, y M. salivarium son aislados de humanos, animales y líneas celulares. La composición nutritiva del medio de cultivo celular provee los esteroles, ácidos grasos, aminoácidos, sales y carbohidratos que las especies de micoplasma necesitan para desarrollarse.
El Mycoplasma puede ser difícil de detectar en cultivos celulares debido a que muchas especies no producen turbidez o efectos citopáticos. Dado su diminuto tamaño y su capacidad de deformación, el mycoplasma pasa fácilmente a través de dispositivos de 0.2 µm.
Filtros de grado esterilizante
Como resultado, la preparación de medios requiere cada vez más del uso de filtros de grado esterilizante de 0.1 µm para asegurar una reducción logarítmica eficiente de Mycoplasma. Este caso práctico presenta nuestros métodos recomendados para una mezcla perfecta de medios, así como una reducción del riesgo de contaminación por Mycoplasma mediante el uso de filtros de grado esterilizante de 0.1 µm validados.
Generalmente se usa prefiltración para eliminar contaminantes particulados y coloidales de los medios y para extender la vida útil de los filtros de grado esterilizante. A una escala de producción, los prefiltros son utilizados frecuentemente para manejar la variabilidad de los medios, de un lote a otro y para asegurar que el vaciado del medio estéril en el biorreactor se haga de forma satisfactoria y oportuna.
El objetivo de la filtración final de grado esterilizante es eliminar bacterias y Mycoplasma para preservar la barrera aséptica alrededor del biorreactor.
Características de los medios filtrados
- Estéril/libre de Mycoplasma.
- Cumplir con la normatividad.
- Promover el adecuado crecimiento y expresión celular.
- Libre de inhibidores del crecimiento y contaminantes.
- Bajo en extractables.
- Bajo nivel o ausencia de endotoxinas.
Selección y validación de filtros
Para aplicaciones de alimentación al biorreactor, se han diseñado filtros de membrana con diferentes características de desempeño como capacidad, permeabilidad y eliminación de Mycoplasma. La capacidad y la eliminación microbiana deberán estar balanceados para garantizar un proceso seguro y eficiente.
Requerimientos durante el desarrollo del proceso
- Experimentos de dimensionamiento del sistema de filtración.
- Validación de esterilidad y eliminación de Mycoplasma mediante métodos de prueba validados.
Requerimientos durante la producción
- Monitoreo de la carga bacteriana.
- Detección de Mycoplasma.
- Robustez del filtro.
- Facilidad para manejar evaluaciones.
Evaluar la capacidad de un filtro a través de su rendimiento en un período dado es un método muy conocido en la industria y de aplicación bastante uniforme. Sin embargo, los métodos para probar la capacidad de eliminación de Mycoplasma de un filtro siguen evolucionando y actualmente no existe un método estándar para este.
Como resultado de esto, se deben realizar pruebas para verificar las propiedades de remoción de mycoplasma de los filtros, utilizando el producto bajo condiciones reales del proceso.
| Criterio | Aspecto que debe evaluarse |
|---|---|
| Riesgo operativo de la unidad | Posibilidad de interrupciones, variaciones y fallos durante el funcionamiento. |
| Compatibilidad del proceso | Integración del filtro con el medio, el equipo y las condiciones de operación. |
| Eliminación de Mycoplasma | Capacidad de remoción comprobada mediante pruebas validadas. |
| Flujo y capacidad de filtración | Rendimiento del filtro durante el período de operación. |
| Validación del filtro | Confirmación de esterilidad, robustez y desempeño bajo condiciones reales. |
Fraccionamiento celular
Resultados de evaluación de membranas
La Figura 1 ilustra la reducción de Mycoplasma y el desempeño de la permeabilidad entre filtros hidrofílicos de 0.1 µm de tres diferentes fabricantes, utilizando un medio libre de materia animal.
En este estudio se probaron muestras de membrana simultáneamente en tres experimentos independientes, utilizando tres cultivos separados de A. laidlawii ATCC® 23206. La carga total promedio por membrana fue de 4.9 x 108 cfu/filtro.
La carga promedio por área de membrana fue de 3.5 x 107 cfu/cm2 (± 3.9 x 106). La eliminación de Mycoplasma y la permeabilidad variaron bajo las condiciones de esta prueba.
El valor de reducción logarítmica fue diferente entre las membranas (ANOVA, α 0.05, P=0.000). Las membranas Millipore Express® SHR 0.1 µm (n = 10) y PES (n = 9) del Fabricante A tuvieron un desempeño equivalente después de la prueba de Tukey.
Sin embargo, las membranas Millipore Express SHR 0.1 µm mostraron menos variabilidad que las del Fabricante A. La membrana PVDF del Fabricante B (n = 11) mostró una menor remoción de A. laidlawii.
El tiempo de flujo fue medido utilizando una suspensión reto de A. laidlawii transformada a permeabilidad (LMH/psid). La permeabilidad reto de la membrana Millipore Express SHR 0.1 µm (n = 6) fue significativamente mayor que las del Fabricante A (n = 6) y las del Fabricante B (n = 8) (ANOVA, α 0.05, P = 0.004).
Microfiltración en el tratamiento de líquidos
La microfiltración es un proceso fundamental en numerosas industrias para garantizar la calidad y pureza de los líquidos. Este método se basa en el principio de separación de partículas mediante una membrana con poros microscópicos, que actúan como filtros selectivos.
La aplicación de la microfiltración se puede llevar a distintos contextos. Desde el tratamiento del agua para su posterior uso en procesos como la ósmosis inversa o la esterilización ultravioleta, hasta la separación de emulsiones de agua y aceite.
En proyectos de filtración relacionados con el tratamiento de aguas residuales, la microfiltración se convierte en una herramienta indispensable: ya sea como sustituto de clarificadores secundarios en reactores biológicos de membranas o en el tratamiento de aguas jabonosas para separar sólidos suspendidos.
La elección entre ósmosis inversa y ultrafiltración depende de las características del agua o líquido a tratar, los objetivos que persigas en el proceso de filtración, tu presupuesto, así como las condiciones del entorno donde se implemente el sistema de filtración.
La ósmosis inversa es muy efectiva para eliminar sales disueltas, compuestos orgánicos y virus y bacterias, gracias a su capacidad para retener partículas incluso más pequeñas que las que puede retener la ultrafiltración. Esto la hace ideal para la purificación de agua potable y la desalinización del agua de mar, así como para aplicaciones industriales que requieren agua de alta pureza.
Por otro lado, la ultrafiltración es especialmente útil cuando se necesita eliminar sólidos suspendidos y partículas de mayor tamaño. Pero no es capaz de retener compuestos disueltos como los que elimina la ósmosis inversa.
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