La purificación de la lactato deshidrogenasa (LDH) se basa en extraer la enzima de un tejido o una muestra biológica, eliminar progresivamente las proteínas y moléculas contaminantes, separar sus isoenzimas y comprobar la actividad enzimática en cada etapa. La LDH es una enzima intracelular presente en casi todos los tejidos del cuerpo, especialmente en el corazón, el hígado, los riñones, los músculos y los glóbulos rojos.
En el laboratorio, el procedimiento combina homogeneización del tejido, centrifugación, fraccionamiento de proteínas, cromatografía y, cuando es necesario, electroforesis. La actividad de la LDH se determina mediante métodos espectrofotométricos basados en la conversión de piruvato y lactato y en la variación de la concentración de NADH.
Fundamento bioquímico de la purificación
La lactato deshidrogenasa o LDH es una enzima intracelular presente en todos los órganos principales. La LDH ayuda a transformar la glucosa procedente de los alimentos en una energía que puede ser utilizada por nuestras células.
La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima que juega un papel crucial en el metabolismo celular, específicamente en el proceso de conversión del lactato a piruvato y viceversa. La LDH es importante en la producción de energía, sobre todo en condiciones anaeróbicas, que es cuando el cuerpo necesita generar energía sin oxígeno.
Durante la glucólisis, el piruvato se convierte en lactato, lo que permite la regeneración de NAD+, un cofactor esencial para la continuidad de la glucólisis. La conversión de lactato a piruvato y viceversa también está relacionada con el equilibrio ácido-base en el cuerpo.
La LDH cataliza la reducción del piruvato utilizando NADH, cuya concentración decreciente se mide como una disminución de la absorbancia a 339 nm, lo que proporciona una cuantificación indirecta de la actividad de la LDH.
Isoenzimas de la lactato deshidrogenasa
La LDH existe en varias formas, llamadas isoenzimas, que se diferencian en su composición y distribución en los tejidos del cuerpo. Existen cinco isoformas de las enzimas LDH, cada una codificada por genes diferentes y que muestran una distribución variable en los tejidos del cuerpo.
| Isoenzima | Distribución predominante |
|---|---|
| LDH-1 | Predomina en el corazón. |
| LDH-2 | Se encuentra en el corazón y en los glóbulos rojos. |
| LDH-3 | Está presente en los pulmones y el tejido linfático. |
| LDH-4 | Se encuentra en el hígado y en los riñones. |
| LDH-5 | Es abundante en el hígado y en los músculos esqueléticos. |
Los distintos tejidos contienen diferentes cantidades y formas; así, mientras que el corazón, el riñón, el cerebro y los hematíes muestran un predominio de la LDH-1, las LDH-2, 3 y 4 destacan en el pulmón, el bazo, las glándulas endocrinas, los nódulos linfáticos y las plaquetas, y la LDH-5 se encuentra fundamentalmente en el hígado y el músculo esquelético.
Se ha propuesto que los perfiles isoenzimáticos varían de acuerdo con las necesidades metabólicas particulares de los diferentes tejidos y que esta variación puede producirse en respuesta a procesos patológicos, como isquemia, inflamación, necrosis o cáncer.
Obtención y preparación de la muestra
La fuente de LDH debe seleccionarse según el objetivo del procedimiento. La enzima puede obtenerse de tejidos ricos en LDH, de células cultivadas, de sangre o de otros materiales biológicos. Las mayores cantidades de lactato deshidrogenasa se encuentran en los músculos, el hígado, los riñones y los glóbulos rojos.
La muestra se mantiene fría durante la preparación para limitar la degradación de la proteína y la pérdida de actividad enzimática. En el caso de una muestra sanguínea, la hemólisis debe controlarse porque la liberación de LDH de los glóbulos rojos puede modificar de forma importante la actividad medida.
En el procedimiento clínico, se extraen aproximadamente 2,5 ml de sangre total mediante venopunción utilizando una aguja estéril. Después de la centrifugación, el plasma separado se analiza inmediatamente o se almacena a 39°F-46°F (4°C-8°C).
Homogeneización del tejido
Cuando la fuente es un tejido, el primer paso consiste en romper las estructuras celulares para liberar la LDH al medio de extracción. La homogeneización debe realizarse en condiciones que mantengan la integridad de la enzima y reduzcan la acción de proteasas y otros agentes que puedan inactivarla.
La LDH es una proteína intracelular. Cuando una enfermedad o lesión daña los tejidos que tienen lactato deshidrogenasa, las células liberan la enzima en el torrente sanguíneo o en otros fluidos corporales.
Después de la homogeneización, la suspensión contiene fragmentos celulares, membranas, núcleos, organelos, ácidos nucleicos, lípidos, sales, proteínas solubles y LDH. Por ello, es necesario separar la fracción soluble de los componentes insolubles antes de aplicar técnicas cromatográficas.
Centrifugación y obtención de la fracción soluble
La centrifugación permite retirar progresivamente el material insoluble generado durante la ruptura celular. El sedimento contiene restos celulares y partículas de mayor tamaño, mientras que el sobrenadante contiene la LDH soluble junto con otras proteínas y moléculas de bajo peso molecular.
La fracción soluble se conserva para las etapas posteriores de purificación. En cada paso debe determinarse tanto la concentración de proteínas como la actividad de LDH, porque la purificación no se evalúa únicamente por la cantidad total de proteína recuperada.
Fraccionamiento inicial de proteínas
El extracto soluble contiene numerosas proteínas distintas de la LDH. El fraccionamiento inicial reduce el volumen de la muestra y elimina una parte de los contaminantes antes de utilizar métodos de separación más selectivos.
Los valores de LDH medidos se interpretan comparándolos con un intervalo de referencia, dividiendo los resultados normales de los anormales. En una preparación de laboratorio, la actividad de la enzima se compara entre el extracto inicial y cada fracción obtenida.
El fraccionamiento puede organizarse de acuerdo con diferencias de solubilidad, carga eléctrica, tamaño molecular o afinidad por determinados ligandos. La elección depende de la fuente de la enzima, del grado de pureza requerido y de la estabilidad de la LDH durante el proceso.
Cromatografía como etapa central
Actualmente, la mayoría de los laboratorios utilizan analizadores automatizados de química clínica que determinan la actividad de la LDH mediante métodos de ensayo espectrofotométricos. En la purificación preparativa, las técnicas cromatográficas permiten separar la LDH de otras proteínas aprovechando sus propiedades fisicoquímicas.
Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas según su carga eléctrica neta. La LDH se une a una matriz con carga opuesta y posteriormente se eluye modificando las condiciones del medio.
La elución puede realizarse mediante cambios graduales en la fuerza iónica o en el pH. Las fracciones recogidas se analizan para localizar aquellas que contienen la mayor actividad de LDH y, posteriormente, se combinan para continuar la purificación.
Cromatografía de exclusión molecular
La cromatografía de exclusión molecular separa las proteínas según su tamaño. Las moléculas de mayor tamaño atraviesan la columna de manera distinta a las moléculas más pequeñas, lo que permite separar la LDH de proteínas contaminantes y cambiar simultáneamente el medio de la muestra.
Esta técnica también puede utilizarse como etapa de pulido para eliminar agregados, fragmentos proteicos o moléculas que tengan un tamaño muy diferente al de la LDH.
Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad aprovecha la unión específica entre la LDH y un ligando inmovilizado en la matriz cromatográfica. La afinidad de la enzima por determinados cofactores, sustratos o análogos permite obtener una separación más selectiva.
Después de la unión, la LDH se eluye modificando las condiciones que mantienen la interacción con el ligando. La cromatografía de afinidad puede proporcionar un aumento considerable de la pureza en una sola etapa, aunque requiere controlar cuidadosamente las condiciones que podrían afectar la actividad enzimática.
Medición de la actividad enzimática
La actividad de LDH se determina midiendo la velocidad de una reacción catalizada por la enzima. La cuantificación indirecta se basa en la disminución de la absorbancia asociada al consumo de NADH.
La LDH cataliza la reducción del piruvato utilizando NADH, cuya concentración decreciente se mide como una disminución de la absorbancia a 339 nm, lo que proporciona una cuantificación indirecta de la actividad de la LDH.
La actividad de LDH se midió a 37 °C, en un autoanalizador Hitachi 917, con reactivos Boerhinger Mannheim (Automated Analysis for BM/Hitachi Sistems).
En una purificación preparativa, la actividad debe medirse en el extracto inicial, en el sobrenadante, en las fracciones cromatográficas y en la preparación final. La fracción con mayor actividad específica se considera la más enriquecida en LDH.
| Parámetro | Utilidad |
|---|---|
| Actividad total | Indica la cantidad global de actividad enzimática recuperada. |
| Proteína total | Permite estimar la cantidad total de proteínas presentes. |
| Actividad específica | Relaciona la actividad de LDH con la cantidad de proteína. |
| Rendimiento | Compara la actividad recuperada con la actividad del extracto inicial. |
| Factor de purificación | Compara la actividad específica de cada etapa con la del extracto inicial. |
Electroforesis de las isoenzimas
La electroforesis permite separar las cinco isoformas de LDH y valorar su distribución relativa. Las isoenzimas se separaron por electroforesis con el sistema Paragon, y se utilizaron kits Tactacte Dehydrogenase Isoenzyme Electrophoresis (Beckman Instruments).
Se utilizó gel de agarosa tamponado con un pH de 8,2. La electroforesis tuvo lugar a 100 voltios durante 20 min; una vez finalizada, se incubaron los geles con un sustrato específico para la enzima durante 30 min a 45 °C en cámara húmeda.
La cantidad relativa de las bandas se cuantificó a 600 nm, en un densitómetro Appraise (Beckman), y la actividad de cada isoenzima se calculó como porcentaje de la actividad enzimática total.
Un examen de isoenzimas de la lactato deshidrogenasa mide los niveles de cinco formas diferentes de LDH. Esta información ayuda a averiguar qué tipo de tejido está dañado, en qué parte del cuerpo puede estar y qué tan grave puede ser el daño.
Control de pureza de la preparación
La purificación debe comprobarse mediante técnicas que permitan determinar si la preparación contiene una sola proteína predominante o una mezcla de proteínas. La electroforesis puede mostrar la presencia de bandas adicionales y ayudar a valorar el grado de homogeneidad.
La actividad enzimática debe conservarse después de cada etapa. Una preparación con mucha proteína total pero con baja actividad específica puede contener una cantidad elevada de contaminantes o una LDH parcialmente inactivada.
La LDH es un marcador sensible, aunque poco específico, de daño celular. Esta misma característica exige distinguir entre la presencia de actividad enzimática y la obtención de una preparación suficientemente pura para estudios bioquímicos.
Interpretación de los resultados de la purificación
El aumento de la actividad específica indica que la proporción de LDH respecto a las proteínas contaminantes se ha incrementado. Sin embargo, una pérdida moderada de actividad total puede producirse durante la separación, especialmente cuando se aplican varias etapas consecutivas.
La purificación más eficiente es la que logra un equilibrio entre pureza, actividad enzimática recuperada y estabilidad de la preparación. Una etapa que aumenta la pureza pero destruye la mayor parte de la actividad puede no ser adecuada para estudios funcionales.
La LDH elevada también es indicativa de procesos oncológicos y hemólisis. En el análisis clínico, un nivel alto de LDH puede reflejar daño celular, pero la prueba por sí sola no puede mostrar qué está dañando los tejidos o dónde se encuentra el daño.
Aplicación de la purificación al análisis de isoformas
La purificación y separación de las isoenzimas puede ayudar a relacionar la actividad de LDH con el tejido de procedencia. LDH-1 y LDH-2 se relacionan con patologías cardíacas. LDH-3 se encuentra en pulmones y es útil en enfermedades respiratorias. LDH-4 y LDH-5 están asociadas a patologías hepáticas y musculares.
Los niveles de LDH en sangre pueden ser utilizados como un marcador diagnóstico en diferentes condiciones médicas, su elevación en sangre se asocia con patologías como enfermedades hepáticas, infartos, cáncer y hemólisis.
En el estudio de la LDH-2 se encontró una significativa correlación negativa tanto con la GOT como con la GPT. La LDH-5 presentó una mayor actividad, y se correlacionó positivamente con el hematocrito y más intensamente con la proteinuria, lo que la asociaría con el daño renal, y la GOT.
La determinación de la LDH-5 en los casos de trastornos hipertensivos del embarazo y su aumento en suero es un indicador de valía, ya que presenta una fuerte correlación con alteraciones importantes en este cuadro, como la proteinuria, y con las alteraciones hematológicas descritas en esta afección.
Aplicaciones clínicas de la medición de LDH
La prueba de lactato deshidrogenasa (LDH) mide la cantidad de una enzima, o un tipo de proteína, en la sangre llamada LDH. Cuando los tejidos se dañan, liberan LDH, lo que puede elevar el nivel de la enzima en la sangre.
- Ayudar a diagnosticar y monitorear enfermedades que afectan a la sangre, incluyendo anemia.
- Evaluar enfermedades del hígado, pulmones, riñones, corazón y páncreas.
- Investigar lesiones musculares, fracturas y quemaduras extensas.
- Apoyar el diagnóstico de infecciones como la mononucleosis, la meningitis y la encefalitis.
- Evaluar algunos tipos de cáncer, como el linfoma, la leucemia, el mieloma múltiple, el seminoma, el cáncer testicular y el melanoma.
- Comprobar si el tratamiento para ciertos tipos de cáncer está funcionando.
La medición de los niveles de LDH en sangre tiene numerosas aplicaciones clínicas, entre ellas la detección de lesiones cardíacas en el infarto de miocardio, la evaluación de la enfermedad hepática y la hepatitis, la identificación de trastornos respiratorios, el diagnóstico de cánceres cerebrales primarios y metastásicos y la predicción de complicaciones.
La LDH aumenta 12 horas después de un ataque cardíaco, alcanza su punto máximo en 2-3 días y vuelve a los niveles basales en 5 a 10 días. Su ascenso y descenso gradual ayudan a diagnosticar y controlar el daño cardíaco.
Valores de referencia y factores que alteran la medición
Los valores normales de LDH varían según el método de medición, pero generalmente se encuentran en el rango de 140-280 U/L en adultos. En niños y adolescentes, pueden ser más elevados.
| Grupo o intervalo | Valor indicado |
|---|---|
| Adultos | 140-280 U/L |
| Hombres | 135-225 U/L |
| Hembras | 135-214 U/L |
Lo que se considera "normal" puede variar según factores como la edad y el sexo. Los rangos de referencia para adultos difieren entre hombres y mujeres, y también pueden variar entre laboratorios debido al método utilizado.
Factores como actividad física, hemólisis en la muestra y enfermedades subyacentes pueden influir en los resultados. Los niveles altos pueden ser causados por ejercicio intenso y ciertos medicamentos, incluyendo la aspirina.
Un exceso de vitamina C podría hacer que el nivel de LDH sea inferior al normal, y algunas afecciones genéticas pueden tener el mismo efecto. Tomar grandes cantidades de vitamina C o vitamina E puede causar niveles bajos.
Precauciones durante la toma de muestras
La prueba de LDH no requiere ninguna preparación especial. No es necesario ayunar previamente, ya que comer no afecta los resultados.
Debe evitarse realizar actividad muscular extenuante el día anterior a la prueba, ya que puede elevar falsamente los niveles de LDH de forma temporal. También es necesario informar sobre cualquier medicamento, suplemento o producto a base de hierbas que se esté tomando.
Es posible tener un nivel alto de LDH si muchos glóbulos rojos se rompieron al recolectar y analizar la muestra. Por esta razón, la hemólisis de la muestra constituye una fuente importante de resultados alterados.
En muestras pediátricas, ciertos factores pueden aumentar el nivel de LDH, así que debe informarse al médico si el niño toma algún medicamento o hace ejercicio vigoroso. Debe evitar hacer ejercicio físico antes del análisis, y un exceso de vitamina C podría hacer que el nivel de LDH sea inferior al normal.
Limitaciones de la técnica
La LDH es un marcador de gran utilidad clínica en la detección de daño celular, aunque su falta de especificidad limita su uso como único criterio diagnóstico. Su interpretación debe realizarse en conjunto con otros parámetros bioquímicos y el contexto clínico del paciente.
Una prueba de LDH por sí sola no puede mostrar qué está dañando los tejidos o dónde se encuentra el daño. Por ello, una prueba de lactato deshidrogenasa generalmente se realiza con otros tipos de exámenes que pueden ayudar a diagnosticar el problema.
Si los resultados muestran niveles de LDH más altos de lo normal, puede solicitarse un tipo más específico de prueba de LDH que ayude a averiguar de dónde proviene la enzima. La información de las isoenzimas permite orientar el análisis hacia determinados tejidos, aunque debe relacionarse con los síntomas y con otros resultados de laboratorio.
La necesidad de efectuar una electroforesis completa de todas las isoformas, así como la existencia de indicadores tales como la GOT, con connotaciones muy parecidas o superiores, deben hacer valorar su determinación en los trastornos hipertensivos del embarazo.
Métodos cromatográficos para la purificación de proteínas
Seguridad del procedimiento analítico
La prueba de LDH es un procedimiento seguro. Las complicaciones poco frecuentes incluyen sangrado excesivo, síncope, infección o coagulación en el sitio de punción. También pueden aparecer hematomas en la piel.
La extracción de sangre suele producir únicamente una molestia leve y el procedimiento puede durar menos de 5 minutos. En una extracción convencional se recogen aproximadamente 2-3 ml de sangre.
Una vez recogidas las muestras suficientes, aplicar un hisopo de algodón y mantener la presión durante 5 minutos detendrá cualquier sangrado o supuración adicional en el lugar de la punción con la aguja.
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