El tiempo de lisis de los leucocitos en agua destilada depende del objetivo del procedimiento, del tipo de muestra y de las condiciones de manipulación. El agua destilada, al no aportar una concentración adecuada de sales, puede alterar el equilibrio osmótico de las células y producir su destrucción.
Sin embargo, el material disponible no establece un tiempo único y validado para la lisis de leucocitos en agua destilada. Por eso, el tiempo no debe interpretarse como un valor universal aplicable a cualquier muestra o protocolo de laboratorio.
Qué son los leucocitos
Los glóbulos blancos (leucocitos) son una parte importante de la defensa del cuerpo contra microorganismos infecciosos y sustancias extrañas (el sistema inmunitario).
Para defender adecuadamente al organismo, un número suficiente de glóbulos blancos (leucocitos) debe recibir el aviso de que un microorganismo infeccioso o una sustancia extraña ha invadido el cuerpo, y llegar al lugar donde son necesarios para, a continuación, destruir y digerir el patógeno o la sustancia dañinos.
Como todas las células sanguíneas, los glóbulos blancos se producen principalmente en la médula ósea.
Se desarrollan a partir de células progenitoras (células madre o precursoras) que al madurar se convierten en uno de los cinco tipos principales de glóbulos blancos:
- Basófilos
- Eosinófilos
- Linfocitos
- Monocitos
- Neutrófilos
Normalmente, las personas producen unos 100 000 millones de glóbulos blancos (leucocitos) al día.
En un volumen de sangre dado, el número de glóbulos blancos se expresa en términos de células por microlitro de sangre.
El número total suele estar entre 4000 y 11 000 por microlitro (4 to 11 × 109 por litro).
Por qué el agua destilada puede lisar los leucocitos
El líquido cefalorraquídeo normal es incoloro e inodoro, transparente, similar al agua destilada.
Esta semejanza visual no significa que el agua destilada sea un medio apropiado para conservar leucocitos.
Los leucocitos son células que requieren condiciones osmóticas controladas para conservar su integridad. Cuando se colocan en un medio hipotónico, el agua entra en las células y puede provocar hinchazón, pérdida de la membrana celular y lisis.
El tiempo necesario para que ocurra este proceso puede variar según la concentración celular, el volumen de agua destilada, la temperatura, la agitación, el tiempo transcurrido desde la extracción y la composición de la muestra.
Por esta razón, el tiempo de lisis debe determinarse mediante un procedimiento validado para cada aplicación y no mediante una cifra aislada.
Factores que modifican el tiempo de lisis
Tipo y concentración de la muestra
Conviene, por tanto, conocer la cifra de leucocitos del paciente para extraer más sangre en caso de leucopenia.
Una muestra con una concentración elevada de leucocitos puede presentar una dinámica distinta de una muestra con pocos leucocitos. La cantidad de células, el hematocrito y la presencia de proteínas o restos celulares pueden modificar el contacto efectivo con el agua destilada.
Temperatura
La temperatura influye en la velocidad de los procesos celulares y en la estabilidad de la membrana. Por ello, un tiempo observado a temperatura ambiente no debe extrapolarse automáticamente a una incubación a 37 ºC.
Se puede incubar a temperatura ambiente. No obstante, es preferible incubar a 37 ºC.
Esta recomendación pertenece al procedimiento de marcaje con 99mTc-HM-PAO y no constituye, por sí misma, un tiempo validado de lisis de leucocitos en agua destilada.
Agitación y manipulación
Mezclar suavemente.
Agitar el tubo suavemente.
La intensidad de la mezcla puede modificar la velocidad con la que el agua entra en contacto con las células y aumentar la fragmentación celular. Una agitación intensa también puede generar restos que dificulten la interpretación microscópica.
Composición del medio
La disolución debe tener una Osmolalidad de 310 mOsm/kg y un pH entre 5 y 7.
Este dato corresponde a una disolución de hidroxietilalmidón y cloruro de sodio preparada en agua para preparaciones inyectables, no a agua destilada sola. La diferencia es importante: una disolución con osmolalidad y pH controlados no equivale a un medio hipotónico de agua destilada.
Tiempo desde la obtención de la sangre
La integridad de los leucocitos puede cambiar durante el almacenamiento. El tiempo transcurrido entre la extracción y el tratamiento de la muestra puede influir en la resistencia celular y en el resultado de la lisis.
Valores y recuento de leucocitos
Mediante análisis de sangre, puede determinarse la proporción de cada uno de los cinco tipos principales de glóbulos blancos, el número total de células de cada tipo en un volumen dado de sangre.
Una cantidad muy alta o muy baja de glóbulos blancos indica un trastorno.
| Situación | Recuento descrito |
|---|---|
| Recuento total habitual | 4000 y 11 000 por microlitro |
| Leucopenia | menos de 4000 células por microlitro de sangre |
| Leucocitosis | más de 11 000 células por microlitro de sangre |
La leucopenia, una disminución en el número de glóbulos blancos (leucocitos) a menos de 4000 células por microlitro de sangre (4 × 109 por litro), con frecuencia hace que los afectados sean más susceptibles a las infecciones.
La leucocitosis, un aumento en el número de glóbulos blancos (leucocitos) de más de 11 000 células por microlitro de sangre (11 × 109 por litro), está causada a menudo por una respuesta normal del organismo frente a algunos fármacos, como los corticoesteroides, o bien para ayudar a combatir una infección.
Sin embargo, un aumento en el número de glóbulos blancos también está causado por cánceres de la médula ósea (como la leucemia), en los que las células afectadas se multiplican sin control.
Tipos de alteraciones leucocitarias
Algunos trastornos solo implican a uno de los cinco tipos de glóbulos blancos.
- La leucocitosis linfocítica consiste en una cantidad anormalmente alta del número de linfocitos.
- La linfocitopenia consiste en un número anormalmente bajo de linfocitos.
- La neutropenia es un número anormalmente bajo de neutrófilos.
- La leucocitosis neutrófila consiste en una cantidad anormalmente alta del número de neutrófilos.
Otros trastornos pueden implicar alteraciones simultáneas de más de un tipo de glóbulos blancos, o incluso de los cinco.
Los trastornos de los neutrófilos y de los linfocitos son los más habituales.
Recuento de leucocitos y utilidad clínica
Este conteo mide el número de glóbulos blancos en la sangre.
También llamados leucocitos, son parte de su sistema inmunitario.
Son un tipo de célula sanguínea que se produce en la médula ósea y se encuentran en la sangre y el tejido linfático (partes del sistema inmunitario).
Si usted se lesiona o enferma, los glóbulos blancos viajan a través del torrente sanguíneo y los tejidos hasta donde se necesitan.
Cuando usted se enferma, su cuerpo produce más glóbulos blancos para combatir las bacterias, los virus u otras sustancias extrañas que han causado la afección.
Otras enfermedades pueden hacer que el cuerpo produzca menos glóbulos blancos de los que necesita.
Esto reduce el número de glóbulos blancos.
Las afecciones que reducen este conteo incluyen algunos tipos de cáncer y el VIH, una enfermedad viral que ataca los glóbulos blancos.
El recuento de glóbulos blancos mide el número total de estas células sanguíneas.
El conteo de glóbulos blancos puede mostrar si el número es demasiado alto o bajo, pero no permite confirmar el diagnóstico.
Por eso, se suele hacer junto con otras pruebas para ayudar a confirmar su diagnóstico.
La lisis dentro del procesamiento de muestras
En los procedimientos de laboratorio, la lisis puede formar parte de una preparación destinada a analizar células, separar componentes o facilitar una observación posterior.
Es aconsejable obtener un número de células superior a 2 · 108 para obtener buenos rendimientos de marcaje y buena calidad de imágenes.
Utilizar dos jeringas A y B, conteniendo 4 ml y 2 ml de ACD-A R respectivamente.
Con ayuda de una palomita de 19 G, extraer sangre en las dos jeringas: en la jeringa A, aproximadamente 30 ml y en la jeringa B, aproximadamente 15 ml.
Introducir 8 ml de hidroxietilalmidón al 6% en la jeringa A sin formar espuma.
Dejar la jeringa en posición vertical durante 1 h aproximadamente, a temperatura ambiente, para que sedimenten los hematies y se obtenga un plasma rico en células (PRC).
Según la velocidad de sedimentación globular, el tiempo necesario para la sedimentación puede variar de 30 min.
Centrifugar la jeringa B a 2.000 · g durante 15 min.
Centrifugar el PRC a 150 · g durante 5 min.
Extraer el plasma sobrenadante y reservarlo para posterior utilización.
Resuspender el botón leucocitario con 1 ml de PLC, removiéndolo por aspiración suave con una pipeta de plástico.
Estos pasos muestran que el procesamiento de leucocitos se realiza habitualmente mediante medios y condiciones controlados, y no únicamente mediante la adición de agua destilada.
Diferencia entre agua destilada y soluciones controladas
Disolver 6.0 g de hidroxietilalmidón cuyo peso molecular promedio sea de 450000, con un grado de sustitución de 0,7 y 0,9 g de cloruro de sodio en 100 ml de agua para preparaciones inyectables R.
La disolución debe tener una Osmolalidad de 310 mOsm/kg y un pH entre 5 y 7.
La presencia de cloruro de sodio y el control de la osmolalidad modifican por completo el comportamiento del medio frente a los leucocitos.
Por ello, no es correcto utilizar el tiempo de sedimentación, incubación o marcaje como si fuera el tiempo de lisis producido por agua destilada.
La adición del 99mTc HM-PAO a los leucocitos debe de efectuarse lo más rápidamente posible, tras la preparación, ya que se forman cantidades crecientes de tecnecio libre y un complejo secundario no lipófilo en función del tiempo.
Se recomienda efectuar el marcaje en un medio al 50 % plasmático.
Una vez suspendido los leucocitos en 0,5 ml de PLC, se añadirán 0.5 ml de 99mTc-HM-PAO.
Incubar 15 min. a 37 ºC.
Centrifugar a 150 · g durante 5 min y extraer el sobrenadante que contiene la actividad no ligada a las células.
Reservarlo para calcular la eficiencia del marcaje.
Lavar con 1 ml de PLC, que se hace deslizar cuidadosamente por la pared del tubo, para evitar que se disperse el botón de leucocitos.
Resuspender el botón leucocitario con 5 ml de PLC y medir la actividad.
Los 15 minutos de incubación descritos corresponden al marcaje celular con 99mTc-HM-PAO y no al tiempo de lisis en agua destilada.
Cómo evaluar experimentalmente el tiempo de lisis
Cuando el objetivo sea conocer el tiempo de lisis, es necesario definir de antemano qué se considera una lisis suficiente. La evaluación puede basarse en la desaparición de células intactas, la liberación del contenido celular, la pérdida de estructuras visibles o la reducción de células viables, según la finalidad del análisis.
- Preparar una muestra de leucocitos con volumen y concentración conocidos.
- Exponer alícuotas independientes a agua destilada durante distintos intervalos.
- Mantener constantes la temperatura, el volumen, el tipo de recipiente y la forma de mezcla.
- Examinar cada alícuota mediante el método analítico previsto.
- Comparar la cantidad de células intactas y de restos celulares.
- Seleccionar el tiempo que proporcione el grado de lisis requerido sin prolongar innecesariamente la exposición.
La cuantificación debe realizarse con controles apropiados, porque una muestra aparentemente transparente no demuestra por sí sola que todos los leucocitos hayan sufrido lisis completa.
También es importante distinguir entre lisis celular y sedimentación. La sedimentación permite separar células o componentes por gravedad, mientras que la lisis implica la pérdida de la integridad de la membrana celular.
Importancia de la observación microscópica
Colocar 10 µl de la suspensión final en un porta y cubrirlo con un cubre.
La observación microscópica puede ayudar a valorar la presencia de leucocitos intactos, células deformadas, membranas fragmentadas y restos celulares.
La interpretación debe realizarse junto con el método de recuento utilizado y con las condiciones exactas de exposición al agua destilada.
En protocolos de marcaje, la calidad de las imágenes depende del número de células y de la conservación de la preparación. Por eso, cualquier procedimiento de lisis destinado a una evaluación posterior debe validar que los residuos no interfieran con la lectura.
Corrección del recuento en muestras contaminadas con sangre
Un problema que puede surgir en la interpretación del LCR se produce cuando una punción lumbar es traumática.
En estos casos la valoración directa de la citología no es correcta y hay que hacer corrección del número de leucocitos obtenidos en el LCR.
Esta corrección se hace de 2 maneras, dependiendo del resultado del hemograma:
- Si el recuento de hematíes y leucocitos en sangre es normal, se descuenta un leucocito en LCR por cada 700 hematíes en LCR.
- Si el recuento es anormal: leuc reales en LCR = leuc LCR-(hematíes LCR/hematíes sangre).
Este ejemplo pertenece a la interpretación del líquido cefalorraquídeo y no debe confundirse con la determinación del tiempo de lisis de leucocitos en agua destilada.
Leucocitos en el líquido cefalorraquídeo
El líquido cefalorraquídeo (LCR) es una solución compleja que se forma principalmente en los plexos coroideos y ventrículos laterales.
Las 3 cuartas partes se localizan en el espacio subaracnoideo y el resto en los ventrículos.
En el adulto, el volumen total es variable, oscilando entre 90 y 150ml.
En el recién nacido, oscila entre 10 y 60ml, pudiéndose duplicar en niños mayores.
La obtención del LCR se realiza mediante una sencilla técnica que se denomina punción lumbar.
Se realiza introduciendo un catéter en el espacio subaracnoideo espinal en la zona lumbar, a nivel de L3-4 o L4-5.
El LCR puede ser extraído con fines diagnósticos y terapéuticos (administrar medicamentos, reducir presión intracraneal), administrar contrastes radioopacos o medir presión intracraneal.
Los valores normales en el recuento celular del LCR van a depender de la edad del paciente.
Al igual que el estudio bioquímico, el estudio citológico es otro pilar en el diagnóstico.
Se valoran leucocitos, hematíes y otras células, como pueden ser tumorales en el caso de leucemias y linfomas con extensión al sistema nervioso central.
Interpretación del aspecto del LCR
El aspecto del LCR tras realizar una punción lumbar nos puede dar una idea inicial diagnóstica.
Un aspecto turbio, poco transparente, nos indica la presencia de células y/o bacterias, lo que nos hace pensar en un proceso infeccioso bacteriano.
Un LCR hemorrágico puede ser debido a punción traumática o a una hemorragia subaracnoidea.
Para distinguir ambas situaciones, nos valemos de cómo se modifica el aspecto del LCR a medida que se realiza la punción lumbar.
Un líquido hemorrágico que se va aclarando a medida que fluye nos hace pensar en una punción traumática.
Si el líquido no se aclara, habrá que pensar en una hemorragia subaracnoidea.
Un LCR xantocrómico (color amarillo-anaranjado) lo encontramos en un paciente con una hemorragia subaracnoidea evolucionada.
Pruebas complementarias relacionadas con los leucocitos
El estudio bioquímico del LCR, principalmente de la glucosa y proteínas, también es de gran utilidad en el diagnóstico de distintas enfermedades.
La concentración de glucosa en el LCR es un reflejo de la concentración en suero, siendo aproximadamente un 50-75% de la concentración en suero.
Un descenso en los niveles de glucosa puede aparecer en meningitis bacterianas, hemorragia subaracnoidea y procesos neoplásicos.
Un aumento de la albúmina en LCR (Q albúmina LCR/albúmina suero > 8×10−3) es indicativo de disfunción en la barrera hematoencefálica y, por lo tanto, compatible con enfermedades como meningitis bacteriana o síndrome de Guillain-Barré.
La presencia de hiperproteinorraquia > 550mg/dl sin pleiocitosis (< 10 mononucleares /mm3) es muy indicativa, aunque no diagnóstica, de síndrome de Guillain-Barré.
La electroforesis de proteínas permite la evaluación de las proteínas que se encuentran en concentraciones elevadas.
La presencia de bandas oligoclonales es típica de la esclerosis múltiple; un pico monoclonal se relaciona con gammapatía monoclonal.
La elevación del lactato en LCR se origina en meningitis bacterianas y es independiente del valor en sangre.
Pruebas microbiológicas
Existen distintas pruebas de laboratorio para la identificación de agentes microbiológicos, unas de detección rápida útiles para un diagnóstico inicial y otras más tardías para un diagnóstico definitivo.
Sin lugar a dudas, de todas las pruebas que se pueden realizar en el LCR, las microbiológicas son las que tienen mayor importancia.
- Tinción de Gram: es una técnica de identificación rápida que bien realizada es positiva en el 75-90 % de los casos.
- Otras tinciones: tinta china para la infección por criptococo, tinción de Ziehl-Neelsen para micobacterias.
- Cultivo: la muestra de LCR se debe cultivar durante al menos 72h a 35°C para obtener un resultado adecuado.
- Determinación de antígenos bacterianos: técnicas rápidas de coaglutinación o aglutinación de látex.
- Estudios con reacción en cadena de la polimerasa (PCR): útiles para infecciones víricas, tuberculosis y otros procesos.
- Serologías: estudio de anticuerpos en el LCR como en la infección por Borrelia y VDRL para el diagnóstico de sífilis.
La tinción de Gram puede identificar cocos gramnegativos (meningococo), cocos grampositivos (neumococo y estafilococo), bacilos gramnegativos (Haemophilus influenzae), bacilos grampositivos (Listeria), etc.
La positividad del cultivo nos da el diagnóstico etiológico definitivo.
La PCR cuantitativa en LCR sirve en las infecciones por virus herpes simple como marcador pronóstico.
Precauciones de interpretación
El conteo de glóbulos blancos no requiere ningún preparativo especial.
Es posible que deba dejar de tomar ciertos medicamentos antes de esta prueba.
Por ello, dígale a su profesional de la salud sobre todo lo que toma.
El conteo de glóbulos blancos puede mostrar si el número es demasiado alto o bajo, pero no permite confirmar el diagnóstico.
Si tiene preguntas sobre sus resultados, consulte con su profesional de la salud.
Los resultados de los conteos de glóbulos blancos se suelen comparar con los resultados de otros análisis de sangre, como la fórmula leucocitaria.
Esta prueba mide la cantidad de cada tipo de glóbulo blanco, como neutrófilos o linfocitos.
La exposición de una muestra a agua destilada para estudiar la lisis debe realizarse únicamente en condiciones de laboratorio controladas y con un método aprobado. No debe utilizarse como procedimiento doméstico ni como sustituto de una prueba clínica.
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