La purificación por columna separa los componentes de una mezcla aprovechando diferencias de afinidad, tamaño, carga, hidrofobicidad o interacción con una fase estacionaria. En función de la molécula y del objetivo experimental, pueden utilizarse cromatografía de afinidad, intercambio iónico, interacción hidrofóbica, exclusión por tamaño o cromatografía mixta.
El flujo de trabajo general comprende el pretratamiento de la muestra, el equilibrio de la columna, la carga, el lavado y la elución. La elección del formato, la resina, el volumen de muestra, el caudal, el tamaño de la columna y las condiciones del tampón determina la recuperación, la pureza y la reproducibilidad del procedimiento.
Principio de la purificación por columna
La purificación de proteínas aprovecha tanto las similitudes como las diferencias entre ellas. Las similitudes se utilizan para eliminar contaminantes no proteicos, mientras que las diferencias se aprovechan para aislar la proteína objetivo del resto.
La cromatografía puede separar biomoléculas por propiedades tales como la carga, la hidrofobicidad o la afinidad. Dependiendo de la molécula, pueden utilizarse diferentes técnicas cromatográficas durante las etapas de captura, purificación intermedia o pulido.
Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad se utiliza habitualmente como etapa de captura en la purificación posterior. La biomolécula objetivo, producida en una mezcla compleja durante el procesamiento inicial, se une específicamente a un ligando presente en la resina de afinidad.
La molécula objetivo se une fuertemente a la resina, mientras que la mayoría de las impurezas relacionadas con el proceso atraviesan la columna o se eliminan durante el lavado. La elución se consigue aplicando un tampón que interrumpe la interacción de unión y libera el producto purificado de la columna.
Esta técnica permite alcanzar una elevada selectividad y pureza desde las primeras etapas del procesamiento, por lo que constituye uno de los métodos de captura más eficientes en el procesamiento biológico.
Exclusión por tamaño
En la exclusión por tamaño, las moléculas se separan según su capacidad para penetrar en los poros de la fase estacionaria. Las moléculas grandes atraviesan la columna por un recorrido más corto, mientras que las moléculas pequeñas penetran en los poros y permanecen más tiempo en el lecho.
Entre los formatos disponibles se encuentran las columnas de exclusión por tamaño con resina exclusiva, las columnas con resina de dextrano y las columnas con resina de poliacrilamida. Los valores de MWCO disponibles incluyen 1.8 kDa, 5.0 kDa, 6,0 kDa, 7,0 kDa y 40 kDa.
Las columnas de exclusión por tamaño se emplean especialmente para el intercambio de tampones, la desalación y la separación de proteínas de moléculas pequeñas.
Intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico separa biomoléculas según las diferencias de carga eléctrica. El pH del tampón y la concentración de sal controlan la interacción entre la molécula y el intercambiador iónico.
La selección del pH es especialmente importante porque la carga neta de una proteína depende de su punto isoeléctrico. La cromatografía de intercambio iónico suele utilizarse como etapa de purificación intermedia o de pulido después de una captura inicial.
Cromatografía de interacción hidrofóbica
La cromatografía de interacción hidrofóbica separa biomoléculas según las diferencias de hidrofobicidad superficial. En la fabricación de productos biológicos, suele utilizarse como etapa complementaria de pulido junto con la cromatografía de intercambio iónico, ya que permite abordar diferencias que los métodos basados únicamente en la carga no siempre resuelven.
Cromatografía mixta
La cromatografía mixta utiliza ligandos que interactúan mediante varias propiedades, como la carga y la hidrofobicidad. Esto permite separar biomoléculas difíciles de resolver con un único modo cromatográfico y puede reducir el número de etapas necesarias.
Pretratamiento de la muestra
Usando la expresión procariota de E. coli como ejemplo, antes de comenzar la purificación, se deben determinar las propiedades fisicoquímicas de la proteína objetivo, incluyendo su punto isoeléctrico (pI) y peso molecular. Estas propiedades se pueden calcular con la herramienta en línea ExPASy.
Conocer el pI permite definir el pH adecuado del tampón, generalmente dentro de ±2 unidades de pH del pI, lo que ayuda a mantener la solubilidad y la estabilidad estructural de la proteína durante todo el proceso. A partir de ahí, se puede seleccionar un sistema tampón adecuado, por ejemplo fosfato, Tris o HEPES, según los requisitos de pH y la compatibilidad con las aplicaciones posteriores.
A continuación, resuspenda el pellet bacteriano recogido en una proporción de 1:10 a 1:20 (pellet: tampón, v/v). La resuspensión debe ser exhaustiva: se puede usar una pipeta de 5 ml para pipetear la mezcla si no se dispone de un homogeneizador, pero el objetivo es obtener una suspensión totalmente homogénea sin grumos sólidos.
A continuación, las células se lisan mediante homogeneización a alta presión o sonicación hasta que el lisado se vea claro y transparente, lo que suele tardar de 2 a 3 ciclos. Evite la sonicación excesiva: el calor excesivo generado durante la sonicación puede desnaturalizar la proteína diana.
Mantenga la muestra en hielo durante todo el proceso y utilice intervalos de pulso cortos, por ejemplo, 3 s encendido/5 s apagado, para controlar la acumulación de calor. Tras la lisis, el lisado crudo debe centrifugarse a alta velocidad, normalmente a 12 000-16 000 × g durante 30-45 minutos a 4 °C, para sedimentar los restos celulares insolubles.
El sobrenadante resultante debe filtrarse a través de una membrana de 0.45 μm o 0.22 μm antes de cargarse en la columna de afinidad. La filtración elimina partículas que pueden obstruir el lecho, alterar el caudal o reducir la capacidad de unión de la resina.
Problemas de filtración y obstrucción
Incluso después de la centrifugación, el sobrenadante puede seguir obstruyendo la membrana del filtro y no atravesarla. Las causas subyacentes suelen ser el exceso de ácidos nucleicos liberados durante la lisis, fragmentos lipídicos residuales de la membrana o agregados proteicos finos.
Estos componentes pueden ser demasiado pequeños o deformables para sedimentarse durante la centrifugación estándar, pero suficientemente grandes o numerosos como para obstruir físicamente los poros de la membrana.
Reducción de la turbidez del lisado
Añada Triton X-100 antes de la lisis. Este surfactante no iónico altera la arquitectura de la membrana celular, promueve una lisis más completa y uniforme y reduce significativamente la turbidez del lisado resultante, lo que facilita considerablemente su filtración.
Una concentración del 0.1 al 0.5 % suele ser eficaz. Triton X-100 es compatible con la mayoría de las resinas de afinidad, pero confirme la compatibilidad con su resina específica antes de usarla.
Eliminación de ácidos nucleicos
Añadir Benzonasa, una nucleasa universal, tras la lisis puede reducir la viscosidad del lisado. El ADN y el ARN genómicos liberados durante la disrupción aumentan drásticamente la viscosidad del lisado y son una de las principales causas de obstrucción de la membrana.
Añadir Benzonasa a 5-10 μg/mL junto con MgCl₂ a 2-5 mM e incubar en hielo durante 15-30 minutos degrada los ácidos nucleicos en oligonucleótidos cortos, restaura la viscosidad normal del lisado y mejora notablemente la filtrabilidad.
Este paso es especialmente importante al trabajar con pellets bacterianos grandes. Si el lisado aún resiste la filtración después de estas intervenciones, considere volver a centrifugar a mayor velocidad, de 20 000-30 000 × g, durante más tiempo.
También puede prefiltrarse a través de una membrana de 5 μm o 1.2 μm antes de pasar a una de 0.45 μm o 0.22 μm. Este método de filtración gradual distribuye la carga de residuos entre varias membranas y evita que alguna se obstruya prematuramente.
Etapas de la purificación en columna
Una vez clarificada y filtrada la muestra, está lista para la carga en columna. La purificación en columna por cromatografía de afinidad se realiza mediante cuatro pasos secuenciales: equilibrio, carga de la muestra, lavado y elución.
1. Equilibrio
El objetivo de la equilibración es alinear las condiciones del tampón dentro de la columna con las de la muestra entrante. Si el entorno de la columna difiere del tampón de la muestra en pH, concentración de sal o contenido de imidazol, la proteína objetivo puede no unirse a la resina de manera eficiente.
Un cambio repentino en el entorno químico local también puede provocar la precipitación de la proteína directamente en el lecho de la columna. Lave la columna con 3-5 volúmenes de columna (VC) de tampón de equilibrio antes de cargarla.
Para la purificación por afinidad de Ni-NTA con etiqueta His, un tampón de equilibrio estándar es: Tris-HCl 20 mM, NaCl 300-500 mM, imidazol 10-20 mM, pH 7.4-8.0.
La concentración relativamente alta de NaCl suprime las interacciones iónicas no específicas entre la resina y las proteínas contaminantes, lo que mejora la selectividad de la unión. Asegúrese de que el tampón esté completamente desgasificado y esterilizado por filtración a 0.22 μm para evitar la formación de burbujas de aire en el lecho de resina.
Nunca permita que la columna se seque por completo durante el equilibrio; mantenga siempre una fina capa de tampón sobre la superficie de la resina para evitar el agrietamiento del lecho o la formación de canales.
2. Carga de la muestra
El caudal durante la carga de la muestra debe ser bajo. Se recomienda un tiempo de residencia de aproximadamente 5 minutos para asegurar que la proteína diana tenga suficiente contacto con la resina para una unión eficiente.
Este mismo principio se aplica al dejar la muestra en reposo en una columna de flujo por gravedad durante unos 5 minutos antes de abrir la salida. Para sistemas FPLC o AKTA, un caudal de carga conservador de 0.5-1.0 mL/min es adecuado para una columna de afinidad de 1-5 mL.
Si el caudal es demasiado alto, una fracción significativa de la proteína diana pasará sin unirse y se perderá en el flujo continuo. Las columnas de flujo por gravedad son inherentemente propensas a caudales inconsistentes y obstrucciones ocasionales.
Si el flujo disminuye significativamente a mitad de la carga, una ligera presión con el émbolo de una jeringa puede restablecerlo, pero evite aplicar una fuerza excesiva, ya que podría compactar o agrietar el lecho de resina.
Incluya 10-20 mM de imidazol en el tampón de carga para la purificación de la etiqueta His a fin de suprimir la unión inespecífica de las proteínas endógenas de E. coli, naturalmente ricas en histidina.
Realice siempre la carga de la muestra a 4 °C para ralentizar la actividad de la proteasa. Finalmente, recopile siempre el flujo de la columna para el análisis SDS-PAGE.
Si la banda diana aparece en el flujo, la unión ha fallado y es necesario solucionar el problema inmediatamente antes de continuar.
3. Lavado
La pureza del producto final depende más de este paso que de cualquier otro. El objetivo del lavado es eliminar las proteínas contaminantes que se han adsorbido de forma inespecífica a la resina, manteniendo la proteína objetivo en su sitio de unión.
El reto consiste en identificar condiciones lo suficientemente rigurosas para eliminar la mayoría de los contaminantes que se copurifican, pero lo suficientemente suaves como para no eluir prematuramente la proteína objetivo.
Para la purificación por afinidad de His-tag Ni-NTA, se utiliza imidazol a baja concentración, de 20-50 mM, para el lavado. El imidazol a esta concentración compite eficazmente con las proteínas no específicas débilmente unidas por los sitios de coordinación de Ni²⁺, sin desplazar el objetivo con etiqueta His, que tiene una afinidad mucho mayor por la resina.
Lavar con 5 CV de tampón de lavado constituye un punto de partida estándar. Si se dispone de monitorización UV280, continuar el lavado hasta que la línea base de absorbancia se estabilice, lo que indica que se han eliminado todos los contaminantes débilmente unidos.
Recoger fracciones de lavado individuales y analizarlas mediante SDS-PAGE. Si el objetivo aparece en las primeras fracciones de lavado, reducir la concentración de imidazol; si persisten bandas contaminantes en la elución, aumentarla.
Esta optimización iterativa guiada por SDS-PAGE es el método más fiable para refinar las condiciones de lavado.
4. Elución
Tras el lavado, la proteína diana se libera de la resina interrumpiendo su interacción con el ligando de afinidad. Para la purificación de His-tag Ni-NTA, esto se logra con imidazol de alta concentración, de 300-500 mM, que compite con la His-tag por los sitios de coordinación de Ni²⁺ y desplaza la proteína.
Recoja fracciones de 0.5-1 mL y manténgalas en hielo durante todo el proceso. Para columnas de flujo por gravedad, identifique las fracciones de pico mediante SDS-PAGE y combine aquellas con una banda nítida en el peso molecular esperado.
Para sistemas FPLC o AKTA, se prefiere un gradiente lineal de imidazol de 0 a 100 % de tampón de elución. El monitoreo UV280 en tiempo real revela exactamente cuándo y a qué concentración de imidazol eluye el objetivo, lo que permite una optimización precisa y reproducible de las condiciones.
Después de combinar las fracciones objetivo, elimine rápidamente el imidazol mediante diálisis o columna de desalación y transfiera la proteína a un tampón de almacenamiento adecuado, por ejemplo PBS, pH 7.4.
El imidazol residual puede inhibir la actividad enzimática e interferir con los ensayos posteriores.
Formatos de columnas
La elección del formato debe adaptarse al volumen de muestra, al número de muestras, al caudal requerido y al tipo de separación. Los formatos disponibles incluyen cartuchos de cromatografía, columnas de centrifugación, columnas de centrifugación cónicas de 50 ml, columnas de flujo por gravedad, columnas de microcentrífuga, placas de filtro de 96 pocillos y columnas de centrifugación cónicas de 15 ml.
| Formato | Aplicación principal |
|---|---|
| Columna de centrifugación | Desalación, intercambio de tampones y procesamiento rápido de pequeños volúmenes |
| Columna de flujo por gravedad | Purificación manual sin sistema cromatográfico automatizado |
| Columna de microcentrífuga | Procesamiento de muestras pequeñas mediante centrifugación |
| Placa de filtro de 96 pocillos | Evaluación paralela de resinas y condiciones de unión o lavado |
| Cartucho de cromatografía | Integración en sistemas de purificación y procesamiento de muestras |
Columnas de centrifugación y desalación
Las columnas de centrifugación y desalación de poliacrilamida Pierce™, MWCO de 7K, 0,7 ml, están diseñadas para el intercambio de tampones y el procesamiento de muestras con un volumen de 30-120 µl.
Las columnas de desalación con MWCO de 7,0 kDa pueden utilizarse para el intercambio de tampones de proteínas. Tras su recepción, deben almacenarse a 4 °C.
También existen columnas de desalación con MWCO de 5.0 kDa, resina de dextrano y formato de columna de flujo por gravedad. Estas columnas son desechables y pueden conservarse a temperatura ambiente o a 4 °C.
Columnas preempaquetadas
HiTrap Desalting son columnas de 5 ml listas para usar preempaquetadas con resina Sephadex G-25 superfina para una desalación e intercambio de tampones rápidos y cómodos.
Estas columnas son reutilizables, tienen un volumen de cama de 5 ml y deben conservarse entre 4 °C y 30 °C en etanol al 20 %. El tamaño de partícula es superior a 20 μm en seco y de 15 a 88 μm en húmedo, con un diámetro interior de columna de 16 mm.
HiPrep 26/10 Desalting son columnas de 53 ml preenvasadas con Sephadex G-25 Resina fina para desalinización e intercambio de tampones.
Estas columnas pueden utilizarse con una bomba de laboratorio o un sistema de cromatografía, por ejemplo, con diseño AKTA. Tienen un diámetro interior de columna de 26 mm y deben conservarse entre 4 °C y 30 °C en etanol al 20 %.
Placas de 96 pocillos
El formato de placa de 96 pocillos permite agilizar la evaluación y el cribado de resinas mediante la ejecución simultánea de múltiples purificaciones. Este enfoque permite comparar las condiciones de unión y lavado en una fase temprana, antes de proceder a estudios de purificación a mayor escala.
Las placas de filtro de 96 pocillos son especialmente útiles para comparar varias resinas, concentraciones de sal, valores de pH, tiempos de contacto y condiciones de elución utilizando volúmenes reducidos.
Selección del volumen de muestra y del MWCO
El volumen de muestra debe ajustarse a la capacidad de la columna y al formato del dispositivo. Entre los rangos de volumen disponibles se encuentran 2-12 µl, 5-14 µl, 20-100 µl, 30-120 µl, 30-130 µl, 40-100 µl, 50-120 µl, 50-150 µl, 70-200 µl, 200-700 µl, 200-900 µl, 300-800 µl, 300-2000 µl, 400-700 µl, 500-2000 µl, 700-4000 µl, 1000-4000 µl, de 0,05 a 0,25 ml, de 0,1 a 1,5 ml, de 1 a 2 ml, de 2 a 4 ml y de 4 a 10 mL.
El MWCO debe seleccionarse según el tamaño de la proteína que se desea conservar y el tamaño de las moléculas que se desea eliminar. Los valores disponibles incluyen 1.8 kDa, 5.0 kDa, 6,0 kDa, 7,0 kDa y 40 kDa.
| MWCO | Uso indicado en el material |
|---|---|
| 1.8 kDa | Separación por exclusión de tamaño |
| 5.0 kDa | Desalación e intercambio de tampones |
| 6,0 kDa | Separación por exclusión de tamaño |
| 7,0 kDa | Intercambio de tampones y desalación de proteínas |
| 40 kDa | Intercambio de tampones y purificación de proteínas |
Purificación FLASH por columna
La cromatografía FLASH es una evolución de la cromatografía en columna que todavía es de uso general en los laboratorios de síntesis orgánica. En general, el compuesto de interés, separado por TLC, ha de tener un Rf de 0.15 a 0.35 con el soporte y fase móvil seleccionada.
La fase móvil, en general, es binaria, con uno de los dos solventes de mayor polaridad para permitir ajustar fácilmente la polaridad media y optimizar la separación. En FLASH la fase estacionaria más usada es gel de sílice, por lo que al aumentar la polaridad del solvente aumenta la velocidad de elución de todos los componentes de la mezcla.
Las fases móviles binarias de polaridad creciente más usuales son cloruro de metileno/hexano, éter/hexano, hexano/etil acetato y cloruro de metileno/metanol. Estas fases móviles, excepto hexano/etil acetato, obligan a trabajar en campana de seguridad.
Conversión de TLC a purificación por columna
Los métodos de purificación en UPFP normalmente se desarrollan en base a datos obtenidos en separaciones previas mediante cromatografía de capa fina (TLC). Los datos de retención obtenidos en TLC se expresan en términos de factores de retención (Rf), mientras que en purificación en columna se usa el término volumen de columna (CV).
Es posible transferir un método TLC a UPFP gracias a la siguiente relación: CV=1/Rf.
De esta relación se deduce que un valor de Rf menor corresponde a un mayor valor de CV que, a su vez, indica un mayor tiempo de interacción entre el compuesto de interés y el material del lecho de la columna.
Un CV alto indica una retención alta y en dos compuestos adyacentes una mayor resolución, caso siempre preferible. Para una buena transposición entre TLC y UPFP es conveniente que los compuestos de interés eluyan en TLC con valores de Rf comprendidos entre 0.15 y 0.35 para obtener altos valores de CV.
Una separación por TLC es siempre isocrática. Se puede transponer tal cual a una purificación FLASH isocrática, pero también puede aprovecharse una purificación FLASH en gradiente.
Una vez obtenidas las condiciones más adecuadas en TLC se puede utilizar una transposición genérica a gradiente. La fuerza inicial puede disminuirse para mejorar la retención inicial.
Trabajar en CV resulta práctico si se trabaja con columnas de diferente tamaño, ya que el gradiente en CV siempre será el mismo.
Resolución y diferencia de CV
Para ΔCV de 1,1 y 0.8 se obtiene la máxima interacción soluto-fase estacionaria. Un ΔCV alto asegura una mayor separación y, por lo tanto, una menor masa de lecho necesaria.
Un ΔCV alto implica en UPFC una mayor separación o una menor necesidad de masa de lecho. Un ΔCV de 2.8 permite utilizar una columna de 25g en lugar de la necesaria de 80g para un ΔCV de 1.1.
En general, si Rf ~0.2 será necesario usar un volumen de solvente equivalente a 5 veces el volumen del lecho de la columna para completar la separación.
Optimización de la fuerza eluyente
Existen situaciones en que interesa cambiar el sistema de eluyentes manteniendo la misma fuerza eluyente. Si en un determinado par eluyente no se logra una separación y retención entre valores de Rf comprendidos entre 0.15 y 0,35, será necesario investigar el comportamiento con pares de eluyentes diferentes.
Esto resulta necesario cuando se requiere una selectividad diferente o cuando el compuesto de interés absorbe fuertemente en la misma longitud de onda que uno de los eluyentes.
El triángulo de selectividad permite al técnico conseguir un cambio en la selectividad del solvente de un modo mucho más rápido que con una selección aleatoria.
La fuerza total de una mezcla puede expresarse como FT = A x FA+B x FB, donde FT representa la fuerza total, A y B los porcentajes de los componentes y FA y FB la fuerza de cada componente.
Si se desea modificar la selectividad para mejorar la separación, se debe analizar el triángulo de selectividad y seleccionar un eluyente lo más alejado posible del grupo del solvente utilizado inicialmente.
Selección del eluyente según la absorción UV
La elección del eluyente también debe considerar la zona de absorción del compuesto de interés. Si el API absorbe a 210 nm y el acetato de etilo tiene un cut-off de 260 nm, el API y sus impurezas pueden absorber a 210 nm al mismo tiempo que el acetato de etilo lo hace fuertemente en esa zona, impidiendo la detección.
Para permitir la purificación se ha de usar otro eluyente polar que sea transparente y que no absorba en la zona de 200-210 nm. El alcohol isopropílico es transparente en esta zona, pero tiene elevada fuerza eluyente.
La acetona es transparente en esa zona y su cut-off es de 225-230 nm. El análisis de separaciones por TLC puede indicar una buena separación con una mezcla binaria C6:AC 40:60, con fuerza 0.34 y diferente selectividad.
Como ΔCV para C6:Ac 40:60 es de 1.54, correspondiente a una separación de dificultad media, se podría seleccionar una columna de 12g, pero para asegurar la máxima separación se opta por una columna de 25g.
Selección de la columna FLASH
Tipo de eluyente y sistema de purificación
En FLASH instrumental las mezclas pueden ser más complejas: algunos instrumentos permiten el control de hasta cuatro eluyentes diferentes.
El ejemplo muestra la separación de una mezcla de dietil y dimetil ftalato en condiciones de gradiente, con ciclohexano:etil acetato 100:0 a 85:15 en 7′ + 13′, y gradiente optimizado.
A un caudal de 30 mL/min, la contrapresión generada por las columnas de 50, 30 y 15 mm es respectivamente de 0.34, 1.03 y 9.65 bar.
La presión depende del tamaño de partícula y de las características del lecho. Las partículas más pequeñas pueden aumentar la eficacia y la velocidad de separación, pero también pueden elevar la contrapresión del sistema.
Capacidad de carga
La cantidad de fase de la columna necesaria para una buena separación depende de la diferencia de Rf entre los compuestos a separar, de su cantidad, de la geometría de la fase y de su empaquetado.
En general, por cada gramo de producto se requiere entre 30 y 100g de soporte en una columna tradicional. En las columnas especialmente diseñadas y empacadas para FLASH, la capacidad de carga puede expresarse como un porcentaje de la masa de soporte.
Una columna tradicional por gravedad de gel de sílice de 40g, en el mejor de los casos, tiene una capacidad de carga de 1.35g. Una columna PF-50SIHC/40, también de 40g, puede admitir hasta 8g de producto.
Tamaño y forma de la partícula
Uno de los mayores problemas en la cromatografía FLASH instrumental surge de la calidad de la fase y del empacado de la columna.
Una columna mediocremente realizada o empacada con fases de granulometría dispersa genera una menor reproducibilidad que la que se obtiene con partículas perfectamente caracterizadas lote a lote y procedimientos de empacado desarrollados en la producción de columnas analíticas y semipreparativas de alta calidad.
El uso de columnas de menor tamaño de partícula puede aumentar la velocidad de la separación en un factor de 3. La disminución de las irregularidades y del tamaño de las partículas, incluso hasta 15um, permite optimizar la purificación FLASH.
La calidad del empaquetado influye en la eficacia, la reproducibilidad, el consumo de eluyente y la estabilidad del caudal. Las columnas preempaquetadas simplifican la preparación al reducir la necesidad de empaquetar la columna en el laboratorio.
Análisis SDS-PAGE después de la purificación
Conserve muestras de cada paso de la purificación: lisado de entrada, flujo continuo, todas las fracciones de lavado y todas las fracciones de elución.
Analice estas muestras en paralelo en un único gel SDS-PAGE. Este análisis completo, fracción por fracción, confirma si la proteína diana se unió a la resina y eluyó según lo previsto.
También identifica qué fracciones contienen contaminantes coeluyentes, revela dónde se pierde la proteína diana durante el flujo de trabajo y proporciona los datos necesarios para optimizar racionalmente las condiciones en experimentos de purificación posteriores.
Analizar solo el pool de elución final no es suficiente; la resolución sistemática de problemas requiere una visión completa de todas las fracciones.
Aplicaciones por tipo de biomolécula
Las resinas de cromatografía están disponibles para aplicaciones de afinidad, intercambio iónico (IEX), interacción hidrofóbica (HIC) y modos mixtos. Los formatos abarcan desde herramientas de evaluación en etapas iniciales hasta resinas a escala de producción utilizadas en la fabricación biofarmacéutica.
Las resinas de afinidad CaptureSelect y las tecnologías POROS se utilizan en la purificación de productos biológicos complejos, incluidos formatos modernos de anticuerpos, vectores virales y proteínas terapéuticas.
Anticuerpos
La purificación de anticuerpos requiere seleccionar resinas de afinidad y de pulido capaces de proporcionar la selectividad, la recuperación y la eliminación de impurezas necesarias.
ARN mensajero
La cromatografía en la producción de mRNA separa los transcritos de longitud completa de las impurezas producidas durante el procesamiento inicial, como la plantilla plasmídica y los productos truncados.
El mRNA purificado puede empaquetarse, por ejemplo, en nanopartículas lipídicas, y formularse para uso terapéutico.
Terapia génica
La terapia génica suele utilizar vectores virales, como AAV o lentivirus, para facilitar la transferencia de material genético.
La cromatografía separa el producto farmacéutico de las impurezas relacionadas con el producto y con el proceso durante las etapas de captura y pulido.
Proteínas recombinantes
Las proteínas terapéuticas recombinantes, incluidas hormonas, enzimas y proteínas de fusión, requieren flujos de trabajo de purificación posterior basados en cromatografía que pueden variar significativamente según la molécula objetivo.
Fraccionamiento de plasma
Las tecnologías cromatográficas selectivas, como la cromatografía de afinidad, favorecen una mayor recuperación y pureza durante el fraccionamiento del plasma sanguíneo.
La selección de la técnica, el formato y las condiciones debe realizarse de acuerdo con el tipo de molécula, el volumen de muestra, la pureza requerida y la compatibilidad con las etapas posteriores.
Introducción a la cromatografía en columna
El control del equilibrio, la carga, el lavado, la elución y el análisis de todas las fracciones permite identificar con precisión dónde se pierde la molécula objetivo y qué ajuste puede mejorar el proceso.
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